尼莫地平对阿糖胞苷诱导HL60细胞凋亡机制影响的研究

　　作者：孙立荣　　作者单位：青岛大学医学院附属医院儿科，青岛 266003

　　【摘要】为了研究尼莫地平对阿糖胞苷诱导HL60细胞凋亡机制的影响，采用琼脂糖凝胶电泳检测其DNA凋亡带，用细胞免疫组织化学方法检测细胞凋亡相关基因bcl2、bax的蛋白表达。结果表明，实验组自培养8小时起琼脂糖凝胶电泳显示典型的DNA梯形凋亡带。Bcl2蛋白表达在各实验组随培养时间延长逐渐下降，而Bax蛋白的表达则逐渐增加，Bcl2/Bax比值逐渐下降，8小时就与对照组出现差异(P<0.05)。结论：尼莫地平及阿糖胞苷均能促进HL60细胞凋亡，诱导其凋亡的机制与下调bcl2及上调bax基因的蛋白表达有关。尼莫地平能加强阿糖胞苷促进HL60细胞凋亡，其机制与协同下调bcl2的表达有关。

　　【关键词】 尼莫地平,阿糖胞苷,凋亡,HL60细胞系 蛋白表达 Bcl2 Bax

　　Abstract The aim was to study the mechanisms of HL60 cell apoptosis induced by nimodipine (NMDP ) and cytarabine (AraC). The DNA fragment was detected by agarose gel electrophoresis. The expressions of bcl2 and bax gene proteins related with apoptosis were investigated by immunohistochemistry. The results showed that HL60 cell apoptosis rate had been increasing in the experimental groups compared with the control group since culturing 8 hours. The expression of Bcl2 protein was lower and the expression of Bax protein was higher in the experimental groups than that in the control group, while ratio of bcl2/bax was lower in the experimental groups than that in the control group. It is concluded that NMDP and AraC induce apoptosis of HL60 cells, and the mechanism of apoptosis induced by them may downregulate the expression of bcl2 gene and upregulate the expression of bax gene. The mechanism of HL60 cell apoptosis induced by AraC and NMDP is probably associated with the downregulation of Bcl2 protein expression.

　　Key word nimodipine; cytarabine; apoptosis; HL60 cell line; protein expression; Bcl2; Bax

　　J Exp Hematol 2007; 15(1):72-75

　　白血病多药耐药性(MDR)的产生是导致化疗失败的一个主要原因[1],凋亡相关基因bcl2、bax的表达与白血病耐药之间有着密切关系[2]。bcl2表达增高能使白血病细胞抵抗糖皮质激素、VP16、DNR、MIT、AraC、VCR、ADM和ATRA等化疗药物及X射线所诱导的凋亡， bax是调节bcl2肿瘤耐药的重要基因之一[3]。研究表明，钙通道拮抗剂尼莫地平(nimodipine, NMDP) 通过加强化疗药物诱导细胞凋亡而达到化疗增强作用[4、5]。NMDP是如何加强化疗药物诱导细胞凋亡的?其作用机制尚不明了。为此，本研究以人类早幼粒细胞白血病细胞株(HL60)为研究对象，探讨尼莫地平对阿糖胞苷诱导HL60细胞凋亡机制的影响，为临床合理用药提供理论依据。

　　材料和方法

　　细胞和主要试剂

　　HL60细胞株引自武汉大学典型培养物保藏中心。NMDP购来自德国拜尔公司，AraC购自上海华联制药厂。Rabbit AntiBcl2、Rabbit AntiBax、SABC试剂盒、DAB显色试剂盒均购自武汉Boster公司。基因组DNA抽提试剂盒购自上海生物工程有限公司，DNA 电泳marker购自TaKaRa公司。

　　细胞培养和分组

　　HL60细胞在含有10%新生牛血清的RPMI 1640培养液中悬浮培养。每2-3天传代1次。实验前调整细胞浓度为5×105/ml。实验时将对数期生长细胞分为4组。A组： 对照组(HL60组); B组：HL60+ NMDP(0.01 mg/ml)组; C组：HL60+ Arac(0.05 mg/ml)组; D组：HL60+NMDP+Arac组。细胞分别培养0、8、16、24小时。

　　DNA琼脂糖凝胶电泳观察DNA梯形条带。取不同培养时间的HL60细胞各1.5×106个，按照DNA抽提试剂盒的说明提取DNA，用冷乙醇洗涤2次，最后在 2.5%的琼脂糖凝胶块上于4 V/cm条件下，电泳1小时，紫外灯下观察DNA电泳条带。

　　凋亡调节基因检测

　　Bcl2蛋白表达 取不同培养时间的HL60细胞各1×106个，离心，涂片，干燥，丙酮固定30分钟。浸泡于1份30% H2O2和50份甲醇的混合液中30分钟，然后加入pH 7.8的0.1%胰酶液中37℃消化10分钟，用PBS洗3次后按照试剂盒说明逐步进行操作，其中阴性对照组不加一抗，改加PBS。最后在DAB试剂显色后，脱水、透明、封片、照相。图象扫描测定积分光密度值。

　　Bax蛋白表达 实验方法与Bcl2蛋白表达的测定相似。

　　统计学处理

　　所有数据均用±SD表示，采用SPSS 10.0统计软件进行方差分析。

　　结 果

　　DNA琼脂糖凝胶电泳

　　B、C、D组细胞于8、16、24小时的DNA电泳图上均可见到明显的梯形条带改变，以C、D两组最明显，对照组无梯形条带。

　　凋亡相关基因Bcl2蛋白表达

　　A组细胞Bcl2蛋白表达呈深棕黄色。实验组随培养时间延长，颜色逐渐变淡，24小时呈浅黄色(图1)。Bcl2蛋白表达在各实验组随培养时间延长逐渐下降，培养8小时，D组降低明显(P<0.05);16小时时各组均下降(P<0.05);D组尤为明显(P<0.01);24小时各实验组均明显低于对照组(P<0.01)，但各实验组间无差异(P>0.05)(表1)。

　　凋亡相关基因Bax蛋白表达

　　A组细胞Bax蛋白表达呈浅黄色。实验组随培养时间延长，颜色逐渐变浓，24小时呈棕黄色(图2)。Bax蛋白表达在各实验组随培养时间延长而增加，培养8小时，C、D两组Bax蛋白表达升高显著(P<0.05);16小时时，以D组升高最明显(P<0.01)。24小时时各实验组与对照组比较均有极显著性升高(P<0.01)(表2)。

　　Bcl2/Bax比值的变化

　　随着培养时间延长，对照组Bcl2/Bax比值无明显变化(P>0.05)，实验组Bcl2/Bax比值逐渐下降，8 小时对各实验组Bcl2/Bax比值明显低于对照组(P<0.05)，以D组降低最明显(P<0.01);16小时时，D组明显低于B、C两组(P<0.05);24小时各实验组仍低于对照组(P<0.05)，而各实验组间无明显差别(P>0.05)。

　　讨 论

　　细胞凋亡是一种主动的、自发的、信号依赖的死亡过程，受基因调控并耗能。其表现为核染色质凝集，DNA降解为180-200 bp整倍数的片段，电泳时呈典型的DNA梯形带,但胞膜完整，台盼蓝染色阴性。本研究显示，NMDP及AraC均能有效地诱导HL60细胞的凋亡，并且其诱导的凋亡率呈时间依赖性，随孵育时间的延长逐渐增加，24小时时最高。

　　临床研究结果表明，某些血液肿瘤和实体瘤中bcl2基因均有高频率表达，容易导致化疗耐受，预后较差。bcl2、bax对凋亡的调控是一个十分复杂的过程，具体机制尚未弄清。目前的研究认为，Bcl2、Bax蛋白可自身形成同源二聚体，二者也可形成异源二聚体，当Bcl2蛋白以同源二聚体的形式存在时，细胞趋向于存活;但当Bax蛋白大量表达自身形成同源二聚体，或与Bcl2蛋白形成异源二聚体达50%时，则细胞趋向于死亡。由此可以认为两种蛋白的表达程度决定了细胞的命运。本实验发现，HL60为Bcl2高表达、Bax低表达细胞。随着阿糖胞苷用药时间的延长，其表达呈反方向，比值下降甚至逆转，Bcl2/Bax表达逆转是NMDP、AraC诱导HL60细胞凋亡的一个重要原因。

　　NMDP可通过有效地阻止Ca2+ 进入细胞内而发挥其生理功能，但Ca2+也可做第二信使参与多种生理和病理过程，在细胞的生命活动中起着重要的作用。Ca2+稳态破坏可诱导细胞凋亡，内质网可在一些刺激下释放其贮存的Ca2+，而线粒体则保证细胞内Ca2+浓度的稳定。线粒体对Ca2+浓集过负荷，可通过激活线粒体膜上的一氧化氮合酶产生一氧化氮而抑制呼吸,同时引起线粒体释放细胞色素C和一些促细胞凋亡因子，从而激活caspase家族引起细胞凋亡[6]。NMDP在诱导HL60细胞凋亡中是否有Ca2+的参与以及如何起作用还有待进一步研究。

　　本研究显示，NMDP不仅可导致这两种蛋白的逆向表达，引起细胞凋亡，而且在AraC诱导HL60凋亡过程中有明显促进Bcl2蛋白表达的下调作用。在用药16小时时发现，NMDP+AraC组Bcl2蛋白量明显减少，与单独AraC组和NMDP组相比有差别，并且用药24小时时与单独NMDP组相比仍有差异。但对Bax蛋白的表达上调无明显促进作用，24小时时各实验组在同一时间Bax蛋白的表达无差别。Bcl2/Bax蛋白比值下降在NMDP+AraC组最明显，16小时时与其它两个实验组相比有差别，但24小时时各实验组间表达无差异。NMDP加强AraC诱导HL60凋亡可能与其下调Bcl2蛋白的表达有关。

　　动物实验证明，NMDP对脑动脉的作用远较全身其他部位动脉的作用强。由于其为脂溶性，具有很高的亲脂性特点，易透过血脑屏障，副作用相对少，故NMDP对预防和治疗髓外白血病可能有独到之处;作为耐药逆转剂，其用药剂量和疗效还有待于进一步的研究。

　　【参考文献】

　　1Nooter K, Sonneveld P. Clinical relevance of Pglycoprotein expression in haematological malignancies. Leuk Res, 1994; 18: 233-243

　　2Yue B, Chen Y, Yu D, et al. Study on the relationship between Bcl2/Bax ratio and growth types of leukemia cells and drug resistance in acute myelogenous leukemia. J Tongji Med Univ, 1998; 18: 101-104

　　3Pepper C, Hoy T, Bentley DP, et al. Bcl2/Bax ratio in chronic lymphocytic leukemia and their correlation with in vivo apoptosis and clinical resistance. Br J Cancer, 1997; 76: 935-938

　　4Konda S, Yin D, Morimura T, et al. Combination therapy with cisplatin and nifedipine induces apoptosis in cisplatinsensitive and cisplationresistant human glioblastoma cells. Br J Cancer, 1995;71:282-289

　　5Sun LR, Liu YM, Pang XY, et al. A research in the apoptotic effects of cytosine arabinoside influenced by nimodipine on HL60 cells. Chinese Paedia J, 2002; 40：362-363

　　6Srivastava RK, Sollott SJ, Khan L, et al. Bcl2 and BclX(L) block thapsigargininduced nitric generation, cJun NH(2)terminal kinase activity, and apoptosis. Mol Cell Biol, 1999; 19: 5659-5674