乙型肝炎疫苗联合卡介苗素在无或弱应答人群中的免疫效果

　　【摘要】 目的：探讨乙型肝炎疫苗联合卡介苗素(BCG)在首次接种乙型肝炎疫苗后无或弱应答人群中的免疫效果，寻找一种提高乙型肝炎免疫成功率的方法。方法：放免法定量检测我院产科出生的婴儿按0、1、6方案(每次10μg)标准全程接种重组乙型肝炎疫苗后乙肝表面抗体的几何平均滴度(geometric mean titer，GMT)，筛选无或弱应答者(GMT<100 U/L)60例，随机分为两组，每组各30例，按0、1、6方案进行再免疫，其中一组同时肌内注射卡介苗素，检测复种前后血清中白细胞介素-12(IL-12)、白细胞介素-10(IL-10)的浓度以及乙肝表面抗体的GMT。结果：注射卡介苗素能诱导无或弱应答婴儿产生较高水平的IL-12、IL-10，并呈剂量依赖性;卡介苗素注射组的抗体应答水平较对照组高，两者差异有显著性(P<0.01)。结论：卡介苗素能有效诱导无或弱应答婴儿机体产生细胞因子IL-12、IL-10，可以提高接种乙型肝炎疫苗应答率，卡介苗素有望作为一种较好的乙型肝炎疫苗佐剂.

　　【关键词】 卡介苗素;乙型肝炎疫苗;白细胞介素-10;白细胞介素-12;乙肝表面抗体

　　接种乙型肝炎疫苗是预防和控制乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)感染的有力措施。但排除宫内感染的因素，仍有约5%～10%的乙型肝炎疫苗接种者经常规的免疫程序后不产生保护性抗体或抗体水平很低，即无或弱应答，其原因可能与遗传因素、免疫系统疾病或其他慢性疾病以及疫苗因素等有关。其中遗传因素特别是与HLA相关的免疫耐受为研究重点[1]。已有研究表明[2]，接种乙型肝炎疫苗后产生无或弱应答的婴儿其血清白细胞介素-12(IL-12)、白细胞介素-10(IL-10)水平往往明显低于强应答者，其原因可能与抗原提呈细胞(antigen presenting cells，APC)功能以及共刺激分子的表达低下，导致IL-12、IL-10等细胞因子分泌不足有关。提高疫苗接种时机体的IL-12、IL-10分泌水平可能会提高疫苗接种的成功率。为此，我们观察了肌内注射卡介苗素对乙型肝炎疫苗接种后无或弱应答的婴儿在复种疫苗时血清IL-12和IL-10水平的变化及抗体应答情况，探讨其作为乙型肝炎疫苗佐剂的价值，现报告如下。

　　1??资料和方法

　　1.1??一般资料??2006年1月至2008年12月温州医学院附属第二医院产科出生按常规3剂标准程序免疫接种乙型肝炎疫苗的婴儿(802例)，3剂标准程序完成后第8周，定量检测乙肝表面抗体的几何平均滴度(geometric mean titer，GMT)，筛选对乙型肝炎疫苗无或弱应答(GMT<100 U/L)的健康婴儿60例，分为两组，即观察组(乙型肝炎疫苗+卡介苗素组)和对照组(单纯乙型肝炎疫苗组)各30例(医药学/临床医学论文 http://www.hi138.com/)。

　　1.2??研究方法??两组均按0、1、6方案(每次10μg)重组乙型肝炎疫苗(上海生物制品研究所分装比利时史克必成公司产品，批号990503)进行再免疫，其中一组同时肌内注射卡介苗素(浙江万马药业有限公司生产，商品名：迪苏)，每次1 mL，每周2次，共三个月。并在复种疫苗前及每次接种乙型肝炎疫苗后次日采血2 mL，离心后，留取上清1 mL置冰箱待检。于复种后的第8周，平均年龄(15±0.7)月，以抗-HBs定量法检测两组乙肝表面抗体的GMT。

　　1.3??试剂和仪器??HBV血清标志物放免法定量检测试剂盒及测定仪(电化学发光，美国罗氏公司提供试剂及测定仪);人IL-12、IL-10酶标双抗体夹心法试剂盒(深圳晶美生物工程公司)。

　　1.4??血清IL-12、IL-10检测??严格按试剂盒说明书操作。

　　1.5??HBV血清标志物放免法定量检测??严格按试剂盒说明书操作。

　　1.6??统计学处理方法??采用t检验(等方差)或t’检验(异方差)和方差分析。

　　2结果

　　2.1??观察组和对照组的血清IL-12和IL-10水平比较??表1、表2显示，在复种乙肝疫苗前对观察组和对照组比较差异均无显著性(P?>0.05);第一次接种后观察组和对照组比较差异均无显著性(P?>0.05);第二、三次复种后，观察组IL-10水平均较对照组明显升高，两组比较差异均有显著性(P<0.05);IL-12水平同样两组比较差异均有显著性(P<0.05)。

　　2.2??接种前、后两组的血清IL-12和IL-10水平比较??由表1、2显示，每一次复种后两组的IL-12和IL-10水平均较接种前差异有显著性(P?<0.05);第二、三次复种后，观察组的血清IL-12和IL-10水平均较接种前明显升高，组间两两比较差异均有显著性(P<0.05)，而对照组复种后组间两两比较差异无显著性(P?>0.05)。

　　2.3??观察组和对照组的复种后乙肝表面抗体应答水平比较??由表3显示，观察组的乙肝表面抗体应答水平较对照组明显增高，两组比较有显著性差异(t?=13.22，P?<0.01)。

　　3??讨论

　　在已知免疫应答中，T细胞表面的CD28分子与其配体B7结合，在防止形成免疫耐受方面起重要作用。IL-12和IL-10是重要的免疫调控因子[3]。IL-12是T细胞亚群1型(Th1型)细胞因子，它不仅可促进T细胞生长和Th1细胞分化成熟，增强自然杀伤细胞与巨噬细胞的细胞毒性作用，而且还可促进B细胞的增殖、分泌和合成抗体，促进γ-干扰素等细胞因子的分泌，促进细胞免疫应答;IL-10是调节巨噬细胞的主要因子，主要由Th2细胞产生，调节T细、B细胞、NK细胞等的分化和增殖。它是一种双抑制的反馈因子，对Th1细胞和Th2细胞增殖有双向调节作用，IL-10、IL-12的产生水平可能直接影响机体在接受外来抗原刺激时抗体的免疫应答能力。文献表明乙肝表面抗体产生低下的人群中共刺激分子CD80和CD28表达不足，IL-12和IL-10分泌低下[4]，该人群即使给予多次的疫苗刺激往往也不能使其产生足够的抗体，国内外研究表明IL-1、IL-2、IL-6、IL-12、IFN-γ、 GMCSF(粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子)均能改善小鼠免疫应答能力，从而显著增加DNA疫苗诱导抗体产生[5]。

　　国内外对使用疫苗佐剂增加接种效果的研究结果表明，磷酸铝、SBAS4(铝剂+S-O脱酰单磷酰脂质A复合物)等作为乙型肝炎疫苗佐剂，是通过增加免疫原与巨噬细胞的相互作用，增加向T细胞呈递抗原来增强对疫苗的免疫应答，但由于其常需与基因疫苗联合，目前未能广泛应用。上世纪末有学者也曾以GM-CSF作为健康成人乙型肝炎疫苗接种的免疫佐剂，结果提示80μg和250μg的剂量不能起明显的佐剂作用[6]。卡介苗素其有效成分CpG-ODN2006 是目前发现的最强的人特异性CpG序列[7-8]，能诱导多种免疫细胞的活化，它通过调节机体内细胞免疫与体液免疫，刺激网状内皮系统，激活单核-巨噬细胞功能，增强机体免疫能力，BCG细胞壁上的相关脂多糖能诱导IFN-γ、IL-12产生，促进Th1分化和大量巨噬细胞聚集活化[9]，研究证实，BCG刺激后，T24细胞表面的钟声蛋白样受体(TLR)2和TLR4表达水平以及IL-12的分泌量增加，且随BCG剂量增加而升高[10]。卡介苗素已被应用于老年慢性阻塞性肺疾病(COPD)的防治[11]，并在抗肿瘤免疫和支气管哮喘防治中有良好的作用，已被广泛应用于临床[12]，但鲜见其作为佐剂与疫苗联合使用的报道。本组资料中，两组在每次接受乙肝疫苗刺激后IL-12和IL-10的水平均有升高，较刺激前差异有显著性，表明两组T细胞的功能不存在一般的免疫缺陷，这与国外的报道一致[13]。第二、第三次疫苗接种后虽两组的IL-12和IL-10水平上升，但观察组上升幅度明显超过对照组，差异有显著性，说明经过注射卡介苗素后，机体在接受抗原刺激时产生IL-12、IL-10等细胞因子的能力增加;但是在第一次复种后对照组与观察组血清IL-12和IL-10的水平相仿，差异不显著，考虑与卡介苗素使用时间短，尚未发挥作用有关。此外，在疫苗的三次复种过程中，观察组每次疫苗复种后IL-12和IL-10水平均较前一次递增，组内比较差异有显著性，证实IL-12和IL-10的分泌量可随BCG剂量增加而升高，表明肌内注射卡介苗素可以调节抗体无或弱应答婴儿的细胞免疫功能，使其IL-10、IL-12等细胞因子分泌增加。在三次复种结束后卡介苗注射组的乙肝表面抗体几何平均滴度较对照组明显升高，说明卡介苗素的确能提高婴儿在再免疫时的抗体应答水平。卡介苗素有望作为一种较好的疫苗佐剂，为提高乙型肝炎疫苗的应答水平开辟新的途径。

　　【参考文献】

　　[1] 梁争论.李河民. 接种乙型肝炎疫苗无低应答与HLA关联的研究进展[J].微生物学免疫学进展,2004, 324(4):54-57.

　　[2] Velu V, Saravanan S, Nandakumar S, et al. Relationship be-tween T-lymphocyte cytokine levels and sero-response tohepatitis B vaccines[J].World J Gastroenterol,2008,14(22):3534-3540.

　　[3] Pannekoea Y,Trum JM,Bleker OP,et al.Cytokine omcentra-tions in seminal.Plasama from subfertile men are not in-dicative of the presence of ureaplasma urealyticum of My-coplasma hominis in lower genital tract [J]. Med Microbiol,2000,49(18):697-700.

　　[4] 黄茵, 陈智, 徐承槐,等. 乙肝疫苗无、弱应答与B7-CD28及IL-12、IL-10的相关性[J].免疫学杂,2002,18(6):452-455.

　　[5] Chow YH, Chiang BL, Lee YL, et al. Development of Th1and Th2 populations and the nature of immune responses tohepatitis B virus DNA vaccines can be modulated by codeliveryof various cytokine genes[J].J Immunol,1998,160(3):1320-1329.

　　[6] Hasan MS, Agosti JM, Reynolds KK, et al. Granulocyte mac-rophage colony-stimulating factor as an adjuvant for hepa-titis B vaccination of healthy adults[J].J Infect Dis,1999,180(6):2023-2026.

　　[7] Hartmann G, Krige AM. Mechanism and function of anewlyidentified CpG DNA motif in human primary B cells[J].J Immunol,2000,164(2):944-952.

　　[8] Todate A,Suda T,Kuwata H,et al.Muramyl dipeptide2Lyssti-mulates the function of human dendritic cells[J ]. J LeukocBiol,2001,70(5):723-729.

　　[9] 周娟.卡介苗在支气管哮喘防治中的作用及影响因素[J]. 国外医学:儿科学分册,2003,30(5):228-230.

　　[10] Scanga CB, Le Gros G. Development of an asthma vaccine:research into BCG[J].Drugs,2000,59(6):1217-1221.

　　[11] 石峰, 魏全红.卡介苗素对老年COPD 缓解期的防治作用[J].温州医学院学报,2002,32(3):174-176.

　　[12] 李响, 龚志勇, 李虹,等. 卡介苗诱导膀胱癌T24细胞表达钟声蛋白样受体和产生细胞因子的研究[J].中华外科杂志,2004, 42(3):177-181.

　　[13] Akbar SM, Abe M, Masumoto T, et al. Mechanism of actionof vaccine therapy in murine hepatitis B virus carriers: vac-cine induced activation of antigen present in gdendritic cells[J].Hepatol,1999,30(5):755-764