哮喘患儿转录因子Ｔ-ｂｅｔ／ＧＡＴＡ-３ ｍＲＮＡ比值及其与Ｔｈ１／Ｔｈ２平衡间的关系

　　作者：檀卫平， 李 静， 夏 焱， 吴葆菁， 麦贤弟， 李晓圆， 黄花荣， 黄绍良 作者单位：中山大学附属第二医院儿科， 广东 广州 510120

　　【摘要】 【目的】 研究转录因子T-bet/GATA-3在小儿哮喘发病以及Th1/Th2失衡中的作用。【方法】 本实验拟通过半定量RT-PCR检测部分哮喘患儿外周血单个核细胞(PBMC)中T-bet、GATA-3 mRNA表达情况，同时采用三色荧光流式细胞仪检测哮喘患儿的Th1、Th2细胞数量，并对T-bet、GATA-3 mRNA表达水平与Th1、Th2细胞比率进行相关分析，了解T-bet/GATA-3对哮喘患儿的Th细胞分化的调节作用。【结果】 哮喘患儿外周血淋巴细胞转录因子T-bet mRNA表达水平显著低于正常对照组，其中哮喘发作组显著低于缓解组(P < 0.05);转录因子GATA-3 mRNA表达水平显著高于正常对照组，哮喘发作组又显著高于缓解组(P < 0.05)。哮喘患儿外周血淋巴细胞亚群Th1百分率显著低于正常对照组，其中哮喘发作组又显著低于缓解组(P < 0.05); Th2细胞百分率显著高于正常对照组，哮喘发作组又显著高于缓解组(P < 0.05)。哮喘患儿T-bet mRNA表达量与Th1细胞比率呈正相关(r=0.731)，与Th2细胞比率呈负相关(r=-0.685);GATA-3 mRNA表达量与Th1细胞比率呈负相关(r=-0.692)，与Th2细胞比率呈正相关(r=0.717);T-bet/GATA-3 mRNA比值与Th1细胞比率呈正相关(r=0.793)，与Th2细胞比率呈负相关(r=-0.639)，与Th1/Th2比值呈正相关(r=0.801)。【结论】 哮喘患儿T-bet/GATA-3 mRNA表达水平失调，与哮喘患儿Th1/Th2失衡密切相关，可作为衡量Th1/Th2平衡的新指标。

　　【关键词】 哮喘; 儿童; T-bet; GATA-3; Th1; Th2

　　T-bet/GATA-3 mRNA Ratio as a Novel Measure

　　of Th1/Th2 Balance in Asthmatic Children

　　TAN Wei-ping， LI Jing， XIA Yan， WU Bao-qing， MAI Xian-di，

　　LI Xiao-yuan， HUANG Hua-rong， HUANG Shao-liang

　　( Pediatric Department， SUN Yat-sen Memorial Hospital， SUN Yat-sen University， Guangzhou 510120， China )

　　Abstract： 【Objective】 To explore the effect of T-bet and GATA-3 mRNA expression on profiles of type 1 and type 2 Th cells in asthmatic children. 【Method】 To detect the mRNA expression of T-bet and GATA-3 in the PBMC by semi-quantitative PCR and determine Th1 and Th2 cell numbers by FACS in 38 asthmatic children， including acute attack group of 20 (age 3-13， 6.2 ± 2.9); 18 of remission group (age 3-12， 6.1 ± 2.5); and 20 healthy control children (age 3-12， 6.9 ± 2.7). 【Result】 It was showed that T-bet mRNA in asthmatic children was lower than control group and lower in attack stage than in remission stage (0.14 ± 0.035 vs 0.21 ± 0.033 vs 0.28 ± 0.031， P < 0.05). To opposite， GATA-3 mRNA was higher in asthmatic children than control group and higher in attack stage than in remission stage (0.49 ± 0.091 vs 0.44 ± 0.083 vs 0.37 ± 0.041， P < 0.05). It was showed that Th1 percentage was lower in asthmatic children than those of control group and lower in attack stage than those of remission stage (9.67 ± 3.80 vs 14.69 ± 3.16 vs 21.18 ± 3.45，P < 0.05). Th2 percentage in asthmatic children was higher than that of control group and higher in attack stage than that of remission stage (20.76 ± 7.95 vs 14.28 ± 1.71 vs 4.1 ± 1.55，P < 0.05). Spearman correlation analysis revealed that T-bet mRNA was positively correlated with Th1 percentage (r=0.731) and negatively correlated with Th2 percentage (r=-0.685). GATA3 mRNA level was negatively correlated with Th1 percentage (r=-0.692) and positively correlated with Th2 percentage (r=0.717). The T-bet/GATA-3 mRNA ratio was positively correlated with Th1 percentage (r=0.793) and Th1/Th2 ratio (r=0.801)， but negatively correlated with Th2 percentage (r=-0.639). 【Conclusion】The T-bet/GATA-3 mRNA expression is closely correlated with Th1/Th2 balance， and the T-bet/GATA-3 ratio may act as a new measure of the Th1/Th2 balance in asthmatic children.

　　Key words： asthma; children; T-bet; GATA-3; Th1; Th2

　　近年研究发现哮喘患者体内最显著的免疫改变是Th1/Th2细胞平衡失调，进而导致IgE合成增加，嗜酸性粒细胞(EOS)增殖增多及凋亡减少，从而介导了气道高反应与慢性气道炎症。尽管目前已广泛认为哮喘气道炎症发生的基础是Th2细胞功能活化，伴随Th2型细胞因子的大量分泌，以前的研究多以检测细胞因子水平来间接代表Th1、Th2细胞功能状态[1]，直接从数量上检测哮喘患者Th1、 Th2细胞分化状态的报道甚少，对影响哮喘患者Th1、Th2细胞分化的上游过程更是了解甚少。最新的研究结果表明，转录因子的选择性表达是对Th细胞定向分化起关键作用的调控因素。其中T-bet(T-box expressed in T cells)和GATA-3 (GATA-binding protein-3)分别控制原初性T细胞向Th1和Th2的定向分化[2]。研究转录因子T-bet/GATA-3在小儿哮喘发病以及Th1/Th2失衡中的作用，国内外尚无文献报道。本实验拟通过半定量逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测部分哮喘患儿外周血单个核细胞(PBMC)中T-bet、GATA-3 mRNA表达情况，同时采用三色荧光流式细胞仪检测哮喘患儿的Th1、 Th2细胞数量，了解T-bet/GATA-3对哮喘患儿的Th细胞分化的调节作用。

　　1 材料与方法

　　1.1 研究对象

　　(1)哮喘组患儿38例，均符合2003年中华医学会儿科学分会呼吸学组修订的儿童哮喘诊断标准[3]。其中，哮喘急性发作组20例，年龄3 ～ 13岁，平均6岁(S=2.9);(2)哮喘临床缓解组18例，年龄3～12岁，平均6岁(S=2.5)，以支气管哮喘急性期发作治疗后持续4周以上无哮喘发作症状、肺部检查正常、近4周内无感染及用糖皮质激素等药物史确定为缓解期纳入标准。确定采集标本前2周内未使用过激素及免疫调节剂。(3)对照组 20例，均为我院职工健康子女或到我院进行入托体检的健康儿童，其中男10例，女10例，年龄3～12岁，平均7岁，平均6岁(S=2.7)。近2周内无呼吸道感染，无其他急、慢性疾病，无过敏性及与免疫密切相关的疾病。

　　1.2 主要试剂

　　TRIzol isolation Reagent购自invitrogen公司，DEPC购自威佳公司，Revert Aid First Strand cDNA Synthesis Kit 购自MBI公司，PCR引物由TaKaRa公司合成，Ex Taq酶、DL2000 DNA Marker购自TaKaRa公司。佛波醇酯(PMA)、离子霉素(ionomycin)、莫能霉素(monensin)、DPBS、皂素(saponin)、多聚甲醛(PFA)均购自Sigma公司，RPMI 1640培养基、胎牛血清购自美国Gibco公司，红细胞裂解液购自美国Pharmingen公司。鼠抗人CD3-TC、鼠抗人CD8-FITC、PE(藻红蛋白)标记的大鼠抗人IL-4单抗、FITC(异硫氢酸荧光素)标记的大鼠抗人IFN-γ单抗、PE标记的鼠IgG2a同种型对照免疫球蛋白、FITC标记的鼠IgG1同种型对照免疫球蛋白、Cy-chrome标记的鼠IgG1以及k同种型对照免疫球蛋白均购自美国Pharmingen公司。

　　1.3 研究方法

　　1.3.1 T-bet及GATA-3 mRNA表达水平的RT-PCR检测 取枸橼酸钠抗凝外周静脉血2 mL，常规分离淋巴细胞。淋巴细胞总RNA提取与定量，参照TRIZOL说明书进行。1%琼脂糖电泳分析RNA的完整性，RNA用荧光分光光度计定量后置-70 ℃保存。取2 μg总RNA根据逆转录试剂盒说明逆转录合成cDNA，所得第一链cDNA产物迅速冰浴后置-20 ℃冰箱保存备用。T-bet引物可扩增长度为312 bp(F：5′-ccgtgactgcctaccagaat-3′，R：5′-tcatg ctgactgcycgaaac-3′)，GATA-3引物可扩增长度为326 bp(F：5′-aggcagggagtgtgtgaact-3′，R：5′-tttttcggtt tctggtctgg-3′)，β-actin引物可扩增片段长度为247bp(F：5′-gtgggccgcccccgacacca-3′，R：5′-cggttggc cttgggattgag-3′)。PCR反应体系：10×PCR buffer 5 μL，10 mM dNTP Mix 5 μL，cDNA(RT产物)2 μL，上游引物20 μmol/L，下游引物20 μmol/L，Taqpolymerase 0.25 μL，灭菌水调总反应体积 为50 μL。94℃预变性5 min;94 ℃ 45 s、55℃ 50 s、72 ℃ 1 min，25个循环;72 ℃延伸7 min。取T-bet、GATA3及β-actin扩增产物10 μL在1.2%琼脂糖凝胶中，100 V电泳20 min。凝胶电泳图像输入Kodak digital Science System DC40凝胶成像系统，应用图像分析软件进行各条带平均灰度值分析，以同时扩增的β-actin为内参照，用转录因子/βactin的比值表示转录因子相对表达量。

　　1.3.2 哮喘患儿Th1/Th2平衡的三色荧光流式细胞仪检测 静脉采血1 mL，肝素抗凝，按1 ∶ 1与RPMI 1640培养基混匀，加PMA 25 ng/L，ionomycin 1 mg/L作刺激原，同时加蛋白质转运抑制剂 monensin 17 mg/L，37 ℃、体积分数5%CO2培养4 h后，裂解红细胞，2 mL DPBS缓冲液洗1次，弃上清，鼠抗人CD3-TC 20 μL、CD8-FITC 20 μL，室温避光45 min。同时做空白对照及同种阴性对照，2 mL缓冲液洗1次，1 500 r/min(r=15 cm)离心5 min，弃上清。加40 g/L多聚甲醛500 μL，固定20 min，1 500 r/min离心5 min，弃上清。然后加含0.1%皂素的缓冲液2 mL破膜10 min，1 500 r/min离心5 min，弃上清。再用大鼠抗人IFN-γ-PE及大鼠抗人IL-4-PE单抗(0.2 μg/管)室温避光孵育30 min，2 mL含0.1%皂素的缓冲液洗1次，1 500 r/min离心5 min，弃上清。最后用500 μL含20 g/L多聚甲醛的DPBS悬浮细胞，上机检测，每一样品检测20 000个细胞。

　　1.4 统计学处理

　　数据用x±s表示，各组间均数比较采用SPSS 10.0软件进行单因素方差分析，检验水准α=0.05。

　　2 结 果

　　2.1 哮喘患儿外周血淋巴细胞转录因子T-bet及GATA-3 mRNA表达水平

　　哮喘患儿外周血淋巴细胞转录因子T-bet mRNA和T-bet/GATA-3 mRNA表达水平均显著低于正常对照组，其中哮喘发作组均显著低于哮喘缓解组(P均 < 0.05);哮喘患儿外周血淋巴细胞转录因子GATA-3 mRNA表达水平显著高于正常对照组，其中哮喘发作组显著高于哮喘缓解组(P < 0.05;图1，表1)。

　　2.2 哮喘患儿外周血淋巴细胞亚群Th1、Th2细胞百分率的变化

　　流式细胞仪检测结果显示哮喘患儿外周血淋巴细胞亚群Th1百分率和Th1/Th2比值均显著低于正常对照组(P均 < 0.05)，其中哮喘发作组均显著低于哮喘缓解组(P均 < 0.05);哮喘患儿外周血淋巴细胞亚群Th2细胞百分率显著高于正常对照组，其中哮喘发作组又显著高于哮喘缓解组(P < 0.05;表2)。

　　2.3 哮喘患儿T-bet/GATA-3 mRNA表达量与Th1/Th2间的相关分析

　　哮喘患儿T-bet mRNA表达量与Th1细胞比率呈正相关(r=0.731)，与Th2细胞比率呈负相关(r=-0.685);GATA-3 mRNA表达量与Th1细胞比率呈负相关(r=-0.692)，与Th2细胞比率呈正相关(r=0.717);T-bet/GATA-3 mRNA比值与Th1细胞比率呈正相关(r=0.793)，与Th2细胞比率呈负相关(r=-0.639)，与Th1/Th2比值呈正相关(r=0.801，P均 < 0.05)。

　　3 讨 论

　　哮喘是一种多种细胞和多种介质参与的慢性气道炎症和气道重塑，在多种细胞和介质构成的复杂网络中，CD4+ T辅助(Th)细胞及其分泌的细胞因子扮演着极其重要的角色[4]。我们在前期研究中以ELISA方法检测哮喘患儿外周血淋巴细胞分泌的细胞因子水平，结果发现，与正常对照组比较，哮喘患儿外周血的淋巴细胞分泌IL-4的能力增强，而分泌IFN-γ的能力降低[5，6]，间接反映了哮喘患儿Th1类细胞功能不足，Th2类细胞功能亢进。近年来，联合运用荧光标记的抗细胞表面抗原和抗细胞内细胞因子单抗，结合短时固定、破膜打孔处理，使我们能从单细胞水平，在同一细胞内同时检测两种或更多的细胞因子，结合表面抗原标记，同时直接对T细胞亚群进行分析[7]。本组研究中我们采用三色荧光流式细胞仪检测哮喘患儿CD4+ T淋巴细胞内IFN-γ与IL-4分泌状态，分析哮喘患儿Th1、Th2，百分率。结果发现，与正常对照组比较，哮喘患儿外周血淋巴细胞中分泌IL-4的CD3+ CD4+ 细胞(Th2)百分率显著增高，哮喘急性期显著高于缓解期;分泌IFN-γ的CD3+ CD4+ 细胞(Th1)百分率显著降低，哮喘急性期显著低于缓解期。进一步直接说明了哮喘患儿体内不仅存在Th2细胞功能的过度活化，Th1型细胞功能不足，在细胞数量上也显示出Th2型细胞的优势分化和Th1型细胞的减少，并且这种趋势在哮喘急性发作期尤为明显。

　　对于影响 T 细胞分化的相关因素近年来进行了大量的研究，由前体T细胞向Th1、Th2细胞分化，是化学环境作用于其表面受体进而通过一系列信号转导引起特征性细胞因子谱选择性表达的过程。近期发现，转录因子T-bet和GATA-3由于可分别与IFN-γ基因及Th2细胞因子基因的启动子区结合，对Th1和Th2两类细胞的发育分化起中心调节作用。GATA-3是锌指蛋白GATA家族成员，能促使Th合成Th2细胞因子。GATA-3基因敲除小鼠合成Th2型细胞因子的能力明显下降，不能形成经典的由Th2介导的气道炎症[8]。而T-bet属于转录因子T盒家族(T-box family)成员，是Th1分化的特异性转录因子[9，10]，T-bet基因完全敲除(T-bet-/-)小鼠，可自发表现出类似于过敏性哮喘特征性的病理炎症改变[11]。本课题组研究发现，气道转染IFN-γ基因或T-bet基因可抑制小鼠的哮喘反应[12，13]。本研究通过半定量RT-PCR检测部分哮喘患儿外周血单个核细胞(PBMC)中T-bet、GATA-3 mRNA表达水平，同时与流式细胞仪检测的哮喘患儿的Th1、Th2细胞数量进行分析。结果发现哮喘患儿外周血单个核细胞T-bet mRNA表达水平低下，GATA-3 mRNA表达水平增高。相关性分析进一步证实哮喘患儿T-bet mRNA表达水平与Th1百分率呈正相关，与Th2百分率呈负相关;而GATA-3 mRNA水平与Th2百分率呈正相关，与Th1百分率呈负相关;且T-bet/GATA-3 mRNA比值与Th1/Th2比值呈正相关。结合国内外的研究结果，我们可初步推断T-bet/GATA-3平衡失调在哮喘发病以及患儿Th1/Th2平衡偏移中起着重要调控作用，并且T-bet/GATA-3 比值检测可作为衡量哮喘患儿Th1/Th2平衡的新指标。

　　【参考文献】

　　黄花荣，麦贤弟. 哮喘患儿外周血CD25与IFN-γ的水平变化及其相关性研究[J].中山医科大学学报， 2002，23(5)：361-363.

　　Finotto S， Glimcher L. T cell directives for transcriptional regulation in asthma [J]. Springer Semin Immunopathol， 2004，25(3-4)：281-294.

　　中华医学会儿科学分会呼吸学组. 儿童支气管哮喘防治常规 [J]. 中华儿科杂志， 2004，42(2)：100-106.

　　Kay A. The role of T lymphocytes in asthma [J]. Chem Immunol Allergy， 2006，91：59-75.

　　檀卫平，黄绍良，麦贤弟，等. 麻疹疫苗反复注射对哮

　　喘患儿IL-12、IL-13水平的影响 [J]. 中国病理生理杂志， 2003，19(2)：226-229.

　　檀卫平，黄绍良，麦贤弟，等. 麻疹疫苗注射对哮喘患儿白细胞介素4、5的下调作用及其意义 [J]. 实用儿科临床杂志， 2003，18(3)：201-202.

　　蒋力学，史桂英，石学耕，等. 新生儿、儿童及成人外周血CD4+和CD8+T细胞分泌IFN-γ及IL-4变化的研究 [J]. 上海免疫学杂志， 2002，22(1)：23-25.

　　Finotto S， De Ssnctis GT， Lehr HA， et al. Treatment of allergic airway inflammation and hyperresponsiveness by antisense-induced local blockade of GATA-3 expression[J]. J Exp Med， 2001，193(11)：1247-1260.

　　Szabo SJ， Kim ST， Costa GL， et al. A novel transcription factor， T-bet， direct Th1 lineage commitment [J]. Cell， 2000，100(6)：655-669.

　　Hohler T， Reuss E， Adams P. A genetic basis for IFN-gamma production and T-bet expression in humans [J]. J Immunol， 2005，175(8)：5457-5462.

　　Finotto S， Neurath MF， Glickman JN， et al. Development of spontaneous airway changes consistant with human asthma in mice lacking T-bet [J]. Science， 2002，295(5553)：336-338.

　　李建国，胡晓文，檀卫平，等. γ干扰素质粒基因转染对支气管哮喘小鼠气道炎症的影响 [J]. 中华呼吸与结核杂志， 2005，28(8)：530-533.

　　檀卫平，黄嘉凌，刘然义，等. 小鼠T-bet基因重组腺病毒载体的构建 [J]. 中山大学学报：医学科学版， 2004， 25(6)：546-548.