发育鼠单次惊厥后脑内N-Cadherin的表达在海马苔藓纤维发芽中作用的研究

　　作者：袁宝强，魏海燕，张丽丽，樊秋萍，戴园园 作者单位：1.徐州医学院附属医院儿科，江苏徐州;2.徐州市儿童医院儿科，江苏徐州

　　【摘要】 目的 探讨单次惊厥发作后脑内神经性钙黏附分子(N-Cadherin)表达与海马结构中苔藓纤维发芽现象之间的关系及其作用。方法 利用腹腔注射戊四氮(PTZ)制作发育期SD大鼠(14天、28天)单次惊厥发作模型，各日龄组随机分为生理盐水(NS)组、PTZ致惊组和吡咯二硫氨基甲酸酯(PDTC)预处理组，采用免疫组化法检测N-Cadherin的表达，利用Timm染色法观察海马苔藓纤维发芽现象。结果 NS组在海马CA3区可见极少Timm染色颗粒，致惊后1周偶见Timm染色颗粒，与NS组相比差异无显著性(P>0.05);致惊后3周可见较多Timm染色颗粒沿海马CA3区呈条带样分布，较NS组明显增加(P<0.01);PDTC预处理组可见Timm染色颗粒较PTZ致惊组明显减少(P<0.05)。同时，NS组14天和28天大鼠海马CA3区可见少量的N-Cadherin阳性细胞，着色不深;PTZ致惊组海马CA3和齿状回门区的N-Cadherin阳性细胞与NS组相比明显增多(P<0.01),PDTC预处理后相同区域内N-Cadherin阳性细胞较PTZ致惊组明显减少(P<0.05)。N-Cadherin与Timm染色颗粒的表达结果与惊厥鼠的日龄并无关联性。结论 单次惊厥发作在幼鼠可以引起海马不同程度的苔藓纤维发芽，而N-Cadherin的分布位置与变化时相与苔藓纤维发芽相吻合，这表明N-Cadherin可能参与或促进了苔藓纤维的发芽。

　　【关键词】 海马苔藓纤维发芽;发育鼠;惊厥;神经性钙黏附分子

　　Study on the expression of N-Cadherin in the process of hippocampal mossy fiber

　　sprouting by single seizure in immature rats

　　YUAN Baoqiang1, WEI Haiyan2, ZHANG Lili1, Fan Qiuping1, Dai Yuanyuan1

　　(1. Department of Pediatrics, Affiliated Hospital of Xuzhou Medical College, Xuzhou, Jiangsu 221002, China;

　　2. Children′s Hospital of Xuzhou, Xuzhou, Jiangsu 221002, China)

　　Abstract： Objective To investigate the relationship between the expression of N-Cadherin in the brain and mossy fiber sprouting in the rat hippocampus following single seizure in immature rats so as to ascertain the possible effect of N-Cadherin. Methods 96 immature rats of 14 d and 28 d each were induced single seizure by intraperitoneal injection of PTZ 60 mg/kg to establish animal model. The rats were randomly classified into three groups, including normal saline control (NS group), PTZ seizure group, pyrrolidine dithiocarbamate (PDTC) pretreatment group. Immunohistochemistry method was used to determine the expression of N-Cadherin in rat hippocampus after seizure, and Timm histochemical technique was adopted to observe mossy fiber sprouting. Results In NS group, Timm-stained granules were rare in the CA3 area of hippocampus, and in PTZ seizure group only a few Timm-stained granules were visible 1 week later. The difference between the two groups was of no statistic significance (P>0.05). Three weeks later, in PTZ seizure group, Timm-stained granules were abundant along the CA3 area in a stratal distribution, with an evident increase compared with NS group (P<0.01). In PDTC group, Timm-stained granules were visible, but were markedly reduced in contrast with PTZ seizure group (P<0.05). Meanwhile, in the CA3 area of hippocampus in NS group, a small amount of N-Cadherin positive cells were visible and were slightly stained. Compared with NS group, in PTZ seizure group, N-Cadherin positive cells had a marked increase in area CA3 and dentate hilus (P<0.01), but they were strongly inhibited in PDTC group (P<0.05). There was no correlation between the expressions of N-cadherin, Timm-stained granules and between the age of rats with seizure. Conclusion Single seizure induces mossy fiber sprouting in immature rat hippocampus, and the location and time phase of N-Cadherin are in accord with mossy fiber spouting after single seizure, which suggests N-Cadherin might be involved in or promote mossy fiber sprouting in hippocampus of immature rats after single seizure.

　　Key words： mossy fiber sprouting; immature rats; seizure; N-Cadherin

　　癫疒间是儿童神经系统的一种常见病。它是一组以反复发作性大脑神经元异常猝发放电所致的暂时性大脑功能失常为特征的慢性疾病。对癫疒间发作后脑损伤的研究发现，反复发作可以引起神经元的坏死、凋亡，以及苔藓纤维发芽(mossy fiber spouting，MFS)引起的异常轴突形成，即突触重建。这些研究目前主要集中在成年鼠的癫疒间持续状态(status epilepticus，SE)模型中，而对于单次发作的研究较少，尤其是对幼年鼠单次发作的研究更少。刘月影等[1]研究发现，单次惊厥发作同SE一样亦可以导致神经细胞的凋亡。进一步研究发现，在神经细胞凋亡或坏死后，成年鼠脑内存在神经细胞增生或神经发生的机制，包括海马内MFS[2]、神经干细胞不同程度的增殖等[2-3]。陈静等[3]发现发育鼠SE后也有显著的神经芽生现象，这种芽生机制比较复杂，有人认为与NMDA受体的激活有关[4]，亦有人认为与神经性钙黏附分子(N-Cadherin)有关[5]。本研究的目的是希望能进一步观察单次惊厥发作是否诱导神经芽生以及了解N-Cadherin在神经芽生过程中是否发挥作用。

　　1 材料和方法

　　1.1 动物及分组 健康SD大鼠14、28天2个日龄组，雌雄不限，共96只，由徐州医学院实验动物中心提供。将各日龄组大鼠随机分为生理盐水(NS)组、戊四氮(PTZ)致惊组和吡咯二硫氨基甲酸酯(PDTC)预处理组，1周末进行Timm染色，3周末进行Timm染色及N-Cadherin检测。所有大鼠均在同一实验室和动物中心操作和喂养，以保持喂养、光照、噪音等条件相同，减少外界造成的差异。

　　1.2 惊厥动物模型的建立和预处理 大鼠腹腔内注射PTZ (60 mg/kg)，然后对惊厥发作程度按Racine[6]分级标准进行评价，选择出现Ⅴ级单次发作者作为惊厥研究模型，对照组用等容NS腹腔注射。PDTC预处理组：于注射PTZ前1 h腹腔注射PDTC(100 mg/kg)。

　　1.3 Timm染色 根据陈静等[3]介绍的方法对实验鼠进行灌注和取材，从视交叉处开始连续冠状切片，片厚5 μm，每只大鼠取不连续部位脑片8～10张。采用Danscher等[7]介绍的Timm 染色方法，并进行适当改进。先配置Timm 混合液，染色前在暗室内将1.5 ml的1.7%硝酸银溶液加入上述Timm 混合液内，放入切片，置26℃水浴箱孵育45～60 min，取出切片后用蒸馏水充分冲洗以终止反应，移出暗室后继续予蒸馏水冲洗，梯度乙醇脱水(100%、95%、90%、80%),二甲苯透明, 中性树胶封片。

　　1.4 免疫组化 采用两步法免疫组化方法，试剂盒购自北京中杉金桥生物公司，一抗为1∶100兔抗大鼠N-Cadherin多克隆抗体，阴性对照用PBS取代一抗，显色剂用DAB和H2O2进行着色，操作步骤按试剂盒操作说明书进行，阳性细胞被染成棕黄色。

　　1.5 结果分析 Timm染色评分标准按苔藓纤维出芽分级表进行半定量评分[8]。0级：未见出芽;1级：偶见点状出芽;2级：可见点状或稀疏状出芽;3级可见片状出芽;4级：可见高度集中的片状出芽;5级：可见浓密片状出芽。N-Cadherin的表达结果以光密度(D)表示，运用LEICA Qwin图像处理与分析系统，随机测定海马CA3区部位，并同时测定同一张切片的胼胝体的D值作为背景，计算出校正D值。

　　1.6 统计学处理 采用SPSS 13.0软件进行统计学处理，两均数间差异的比较采用两独立样本t检验，苔藓纤维出芽分级评分结果采用两样本比较秩和检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

　　2 结 果

　　2.1 行为学观察 实验组注射PTZ后1～2 min进入潜伏期，大鼠由自由活动状态逐渐转为安静或伏卧，随后出现眼神呆滞，头面部肌肉轻微抽搐，出现湿狗样抖动并伴有须动、耳抖和搔抓动作，继而进入大发作期，渐次出现前肢阵挛、奔跑跳跃、后肢站立伴头偏向一侧及全身阵发性抽动;达到V级发作的动物则表现为摔倒、翻滚等全身强直-阵挛性发作，同时伴有喉鸣、口角流涎、肢端青紫等。发作持续约2～4 min后逐渐缓解，发作停止后，动物自行活动，若再次出现惊厥发作则被剔除。NS组：注射NS后无任何发作迹象和抽搐表现，行为正常。

　　2.2 Timm染色结果 NS组可见极少Timm染色颗粒，致惊后1周偶见Timm染色颗粒，与NS组相比无明显差异(P>0.05);致惊后3周可见较多Timm染色颗粒沿海马CA3区呈条带样分布，半定量评分在2分左右，较NS组明显增加(P<0.01)，见图1A、表1 ;PDTC预处理组Timm染色颗粒较PTZ组减少(P<0.05)，见图1B。根据苔藓纤维发芽评分标准，致惊后3周CA3区Timm评分明显高于相应日龄NS组(P<0.01)，但两日龄组间无明显差异(P>0.05)。表1 致惊后1～3周海马CA3区Timm染色评分

　　2.3 N-Cadherin免疫组化结果 NS组大鼠海马可见少量N-Cadherin阳性细胞，着色不深;致惊后3周可见CA3和齿状回门区有较多的N-Cadherin阳性细胞，主要表现为胞质和核膜棕黄色，均匀弥漫染色(图2A)，利用显微图像分析系统测得D值明显高于正常对照组(P<0.01)，但两日龄组间无明显差异(P>0.05)，见表2。PDTC预处理组两日龄大鼠海马CA3和齿状回门区有较多的N-Cadherin阳性细胞，但明显较PTZ组减少(P<0.05)，见图2B。

　　3 讨 论

　　MFS是指齿状回颗粒细胞轴突发出侧枝，改变了原来的走行方向，穿越颗粒细胞层，投射于内分子层，形成纤维丛，并与此层密集的颗粒细胞及中间神经元树突形成新的突触联系，并能投射到CA3区的锥体细胞。SE实验鼠和癫疒间反复发作人类的海马研究均表明在SE和癫疒间反复发作后的海马结构中存在着明显的MFS现象。因此，目前认为MFS是癫疒间发作后非常重要的病理改变，并与癫疒间的反复发作、认知功能改变有着直接关系。

　　本实验中我们采用PTZ腹腔注射诱发发育鼠急性化学点燃模型，利用特异的Timm染色方法对海马苔藓纤维发芽进行了观察，发现14和28天日龄组在生理状态下存在少量的Timm染色颗粒，而在单次惊厥后1周偶见苔藓纤维发芽，但缺乏统计学意义。尽管如此,这也表明正常生理状态下存在着正常的MFS，因而发挥着正常的大脑生理功能。单次惊厥发生后1周异常的MFS即开始出现，3周后MFS改变最为明显。这一现象既说明单次惊厥后的确存在着异常的MFS现象，同时也说明了惊厥后异常的MFS改变需要一定的时间。Okazaki等[8]在海人酸(KA)致大鼠SE模型中发现苔藓纤维发芽一般出现在致惊后的2周，并于2个月后达到高峰。黄亚玲等[9]研究发现，出生后10天幼鼠反复惊厥后2～3周也可见明显苔藓纤维发芽。因此，我们认为不管是单次惊厥还是SE及反复发作都存在MFS异常改变，而且MFS与惊厥发作后的时间长短有一定的相关性。

　　从我们的实验结果还可以看出在单次惊厥发作后3周存在的MFS程度与实验鼠的日龄似乎没有明显的相关性，也就是说不管是14天日龄大鼠还是28天日龄大鼠在相同的刺激下在一定的时间内均可以产生异常的MFS。但是，Cilio等[10]在毛果芸香碱所致的SE模型中发现12天致惊大鼠海马内无苔藓纤维发芽现象，而在16天和20天致惊大鼠海马却出现明显的苔藓纤维发芽。Haas等[11]在KA模型中也发现16天致惊鼠于致惊后无苔藓纤维发芽。因而表现出发育鼠惊厥后苔藓纤维发芽可能具有一种年龄及动物模型的特异性。如何对此现象进行解释，目前尚无一致的看法，我们的观点认为可能与发作类型、发作持续时间及模型诱导剂等有关。

　　尽管本实验显示致惊后1～3周海马结构中出现异常的苔藓纤维发芽，但是评分等级多为1～2分，少有更高的评分结果，且14、28天日龄大鼠的苔藓纤维发芽无明显差异，这可能与发作类型为单次惊厥、持续时间较短以及实验对象为幼鼠等诸多因素有关。Lemos等[12]的研究发现，疒间性发作频率高的大鼠比发作频率低的大鼠苔藓纤维发芽密度更高。

　　对于癫疒间发作如何诱导海马异常苔藓纤维发芽过程，目前众说纷纭。有人认为兴奋性氨基酸受体上调是主要原因之一[4]，也有人认为与神经生长因子、脑源性神经营养因子有关，也有人认为与细胞黏附分子有关，认为N-Cadherin在其中可能发挥着重要的作用[13]。

　　N-Cadherin是钙黏附蛋白家族中第1个在中枢神经系统中发现的成员，研究表明它在神经发育中起着非常重要的作用。但是N-Cadherin在癫疒间发作诱导MFS过程中的作用与地位目前缺少深入研究。Fujita 等[14]在KA诱导的惊厥模型中发现注射KA后12～24 h，N-Cadherin mRNA的表达随着神经元的减少而减少，而在48 h至7 天，mRNA的表达部分恢复;而免疫组化染色显示KA注射后48 h，N-Cadherin蛋白在存活神经元中的表达明显增高。这些结果表明N-Cadherin可能参与了海马神经元的重建。Shan等[15]发现在匹鲁卡品诱导SE大鼠后1～4周N-Cadherin mRNA和N-Cadherin蛋白表达逐渐增高，并在发作后4周达到最高水平，更为重要的是N-Cadherin上调的部位和MFS的部位重合，因而认为N-Cadherin与神经再生和突触重建密切相关。

　　在本研究中我们选择单次惊厥后3周作为观察点，发现在明显出现Timm染色颗粒的同时，N-Cadherin表达亦明显增高。进一步研究发现，出现的Timm染色颗粒和N-Cadherin阳性细胞均位于海马CA3区，因此，我们认为两者在时间上及上调的部位有一致性，与SE模型结论一致[13]。

　　另外，我们实验还发现PDTC预处理后MFS发生和N-Cadherin的表达较PTZ惊厥组明显降低。PDTC作为NF-κB的非特异性抑制剂，可以部分抑制惊厥后神经元的凋亡，从而减弱了MFS发生的刺激因素，而作为纤维发芽、延伸和投射过程中的一个关键因子，N-Cadherin的表达也降低。

　　从本实验结果可以看出, 同癫疒间持续状态和反复癫疒间发作一样，单次惊厥发作同样存在不同程度的苔藓纤维发芽，且N-Cadherin可能参与或促进了苔藓纤维的发芽。

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