MMPs在新生儿缺氧缺血性脑病中的研究进展

　　作者：刘春晓 律鹏 作者单位：青海省妇女儿童医院

　　【关键词】 新生儿

　　基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases, MMPs)是一类结构与氨基酸组成相似，依赖锌离子的蛋白水解酶，迄今为止已经发现了26种[1]。新生儿缺氧缺血性脑病(HIE)是指在围产期缺氧窒息导致的脑组织缺氧缺血性损害。其在围产期神经系统疾病中占重要位置。近年来MMPs与HIE的关系逐渐为人们所重视，尤其是MMP-9、MMP-2与缺氧缺血性脑损伤关系密切[2]。本文针对此作一综述。

　　MMPs家族参与正常和病理条件下的组织重构，在细胞外基质(ECM)的正常代谢过程中有着重要生理调控作用。MMPs能够降解ECM和基底膜，是肿瘤浸润转移过程中最重要的调控分子之一，涉及肿瘤浸润、转移和血管的生成，在肿瘤的发展中起关键作用，其对正常和恶性细胞在体内的迁移起着关键作用[3]。MMPs作为调节分子，通过酶级联功能作用于基质蛋白、细胞生长抑素、生长因子和粘附分子，产生增加或降低生物学效应的碎片，从而发挥其生理调节作用[4]。

　　1 MMPs的结构、分类和功能

　　1.1 MMPs的结构

　　MMPs是一组含锌的肽链内切酶，属中性蛋白酶基因家族，为金属蛋白酶超家族中的亚型。MMPs有着共同的分子结构，自氨基端的羧基端依次为信号肽结构域、前肽结构域和催化结构域[5]。MMPs由至少15个锌依赖的肽链内切酶组成并在细胞外起作用。每一个MMPs都含有HExGHxxGxxHS/T保留顺序的蛋白酶区域，在这一区域三个组氨酸残基形成了带有一个锌原子的复合体。此外，所有的MMPs都含有PRCGxPD保守结构的调节区域(MMP原片段)，这一区域对通过与半胱氨酸残基活性部位的结合保持MMPs的潜能[6]。

　　1.2 MMPs的分类

　　根据MMPs作用底物不同的基质特异性和主要结构的不同分为四类：第一类是胶原酶，包括MMP-1(缝隙胶原酶)、MMP-8(嗜中性胶原酶)、MMP-13(胶原酶-3)和可以裂解纤维状的胶原(I、II、III)。第二类是白明胶酶，主要为MMP-2和MMP-9，可以降解白明胶及膜下层的IV型胶原。第三类是基质降解酶，包括MMP-3、MMP-10和MMP-11，它们对ECM(蛋白聚糖、层粘连蛋白、纤维结合素、玻璃体结合蛋白及某些类型的胶原)起抑制作用。第四类包括膜型MMPs，它们可降解一些ECM成分并能激活其他MMPs[3，4]。

　　1.3 MMPs的功能

　　组织中ECM的合成和降解处于严格的调控之下，当这种平衡被破坏时，组织的形态和功能就会改变。许多酶类可以降解ECM成分中的大分子蛋白，MMPs被认为是最重要的一种，因为：(1)MMPs直接以酶原的形式分泌到基质中，并在正常生理条件下发挥作用;(2)MMPs的表达及活性均受到严格的调控，且在ECM重组部位易于诱导表达;(3)MMPs中的一些酶是迄今为止已发现的惟一能分解纤维类胶原的酶[7]。MMPs其主要功能是降解基底膜的主要成分：明胶、IV型、V型胶原、粘连蛋白、弹性蛋白及纤连蛋白。MMPs具备六个基本特征[8]：(1)降解细胞外基质成分(ECM);(2)以一种潜在的酶原形式分泌并在蛋白水解的作用下活化;(3)活性中心含有Zn2+;(4)需要Ca2+存在以维持稳定;(5)在中性pH值条件下起作用;(6)在体内存在着其天然激活剂和抑制剂(TIMPs及血浆抑制因子α2巨球蛋白)。

　　2 MMPs的调控

　　由于MMPs一旦激活将完全降解ECM，因此控制它们的活性很重要。MMPs活性的控制发生在以下三个水平：转录、潜在酶原的激活和内源性抑制剂(TIMPs)的抑制。

　　2.1 转录水平

　　细胞因子、生长因子及原癌基因均可在转录水平调控MMPs。MMPs含有核因子2κB(nuclear factor2κB, NF2κB)的结合位点。因此,细胞因子和生长因子可通过NF2κB而调节MMPs的表达,如白细胞介素1、血小板源性生长因子、肿瘤坏死因子等使其表达增加[9]。在成人正常组织，大多数MMPs的表达水平很低，但是在一定的生理和病理组织重构过程中表达水平上调。正常生理状态下如月经、胚胎发育、排卵、骨的形成和伤口愈合等组织损伤修复过程，病理状态如关节炎、肿瘤病灶的迁移、牙周疾病、动脉粥样硬化和心脏疾病等情况下MMPs表达水平上调[3,4,7]。对转录水平的调节是通过不同的炎症细胞素、激素和生长因子介导，如：白介素1和6、肿瘤坏死因子和基本纤维原细胞生长因子和CD40[9]。

　　2.2 酶原激活水平

　　生理情况下，MMPs主要以无活性的酶原形式存在，大多数以酶原的形式分泌到细胞外，属于分泌型，只有被活化才能降解基底膜。MMPs的活化过程是将其前区劈开，使半胱氨酸与锌离子分离，从而暴露出锌离子活性中心。普遍认为的活化方法是通过纤溶酶原激活物(plasminogen activator, PA)启动瀑布式酶联激活反应，PA主要活化为MMP-9前体[10]。MMPs存在以下三种不同的激活机制[11]：(1)阶梯式激活：这一机制有血浆酶、激肽释放酶、食糜酶、胰肽酶和胰岛素参与。其中血浆酶是体内最有效的生理激活剂。血浆酶攻击MMP肽原部位蛋白酶敏感区域，引起肽原构象的改变，使得激活部位更容易被第二个蛋白酶裂解。(2)被细胞表面的MT-MMPs激活：MMPs在细胞表面的激活对在细胞迁移时降解细胞外周ECM很重要。除了血浆酶形成系统，其他酶也能在质膜上激活MMPs。 (3)细胞内激活：对于细胞内MMP的激活机制和细胞内MMP活性的作用尚不清楚。

　　2.3 金属蛋白酶组织抑制剂(TIMPs)的调节水平

　　细胞在分泌MMPs的同时也分泌TIMPs，以内源性抑制剂TIMP1最为重要。MMP-9前体与TIMP1以非共价键形式形成1∶1复合物，几乎不可逆地抑制MMP-9的激活[12]。正常状态下，MMPs与TIMPs保持平衡，脑缺血后MMPs增加，平衡状态破坏，造成血脑屏障(blood-brain barrier，BBB)损伤。MMPs及其组织型抑制物的动态平衡失调是导致细胞外基质加速分解、血管粥样斑块纤维帽松动、破裂的关键因素。另外,血浆中的α2巨球蛋白是一种非特异性蛋白酶抑制剂，也能抑制MMP-9的活性。

　　3 MMPs与HIE

　　缺血所造成的BBB开放和破坏机制，是由多种因素参与的一系列瀑布样反应过程，最终由MMPs 等一些蛋白酶直接参与到BBB的开放和破坏[13]。过度表达的MMP-9可破坏血脑屏障，造成血管源性脑水肿，同时炎性细胞侵入缺血受损的脑组织[14]。MMPs对神经系统的作用和影响十分广泛，其中的明胶酶家族成员有明胶酶-A(MMP-2)和明胶酶-B(MMP-9)，能够分解破坏内皮细胞基膜[15]。国内外研究证实，脑缺血时MMPs表达升高，降解细胞外基质导致血脑屏障破坏，加重血管源性脑水肿、出血或神经元损伤[16，17]。

　　缺氧缺血(HI)被认为是围产期脑损伤的主要原因，可导致严重程度不同的多种损伤,包括局灶性细胞死亡、弥漫性白质损伤、囊性或腔隙性梗死。估计将近40%的早产儿可能遭受脑室出血或脑室周围病变，而孕龄短、体重轻的早产儿具备更高的风险性[18]。

　　3.1 MMPs与缺氧

　　缺氧环境中，肿瘤细胞的侵袭能力大大增强，这种侵袭能力的加强可能与包括尿激酶或MMPs的变化有关。经研究证实，通过模拟体外缺氧环境，肿瘤细胞的MMP-9转录和表达水平提高,细胞的侵袭性也相应提高[19]。在大脑的发育中，小胶质细胞通过各种机制介导着神经炎症反应[20]。在缺氧缺血情况下，激活的小胶质细胞伴随着MMPs表达的增加上调细胞因子和趋化因子的表达[21]。从激活的小胶质细胞中释放的蛋白酶导致基底膜的成分发生蛋白水解样降解，由BBB降解产生的渗出物允许外周血单核细胞和巨噬细胞进入大脑，进一步增加免疫细胞在病灶处的聚集[22]。近期的实验发现组织损伤后CD11b激活的小胶质细胞表达MMP-9，同时神经退行性和明胶活性增加时小胶质细胞MMP-9表达亦增强[23]。虽然MMP活性往往与炎症过程相关，但是大量的研究数据显示，MMPs活性可以在神经保护方式中改变细胞生长、信号和迁移[24]。

　　3.2 MMPs与血脑屏障

　　缺血性脑损伤无一例外可导致BBB结构的完整性破坏并使其通透性增加，造成严重的神经功能损伤[22]。脑缺血早期即出现细胞因子和黏附分子的表达，促发炎症级联反应，导致白细胞活化，这是BBB损伤的基础[25]。脑组织中包括胶质细胞、小胶质细胞、毛细血管内皮细胞、巨噬细胞、中性粒细胞等多种细胞可产生MMPs。MMPs系统对毛细血管基底膜的降解作用亦可能是导致BBB损伤的重要原因之一，而MMPs的调节对BBB的影响较复杂，许多作用途径尚不清楚[26]。

　　研究表明，MMPs特别是MMP-9在缺血早期BBB损伤中起重要的作用[22]。其中与BBB破坏最为密切的MMP-9主要由脑血管内皮细胞合成。脑缺血早期即出现MMPs表达升高，并参与脑缺血引发的一系列生理病理改变如脑血管通透性增加、炎性反应、BBB破坏。脑梗死后缺血及缺血再灌注损伤引发MMP-9的表达诱导,涉及到c-fos、c-jun等即早基因;TNF-α、白介素等细胞因子;部分趋化因子以及氧自由基参与的一系列连续反应。MMP-9前体的激活是蛋白酶参与BBB破坏反应的关键环节，MMP-9的激活需MMP-3、氧自由基的作用，MMP-3自身的激活可能需要纤维蛋白溶解酶的作用[27]。

　　MMPs一旦激活即能降解脑血管上的关键蛋白质，通过降解MMP-2、MMP-9的作用底物基底膜成分如Ⅳ型胶原、层黏连蛋白和纤黏连蛋白等导致BBB完整性的破坏，使通透性增加，致渗漏和破裂，从而导致了二次损伤的发生。其亦有助于中性白细胞的迁移,加重缺血局部的炎症反应。构成BBB的蛋白质ZO-1被认为是MMP-9的底物[28],MMP-9破坏BBB主要是通过降解ZO-1蛋白导致其完整性的损伤,并参与脑白质的破坏。

　　据报道，大鼠创伤性脑损伤后，创伤灶周围脑组织MMP-2、MMP-9表达增加,同时有毛细血管通透性增加，电镜可观察到明显的微血管内皮细胞紧密连接开放、基底膜破坏、微血管周围水肿。提示脑损伤后增高的MMP-2和MMP-9可能是通过作用于BBB内皮细胞之间的紧密连接和基底膜而导致BBB破坏、通透性增加,引起毛细血管内的水分与血浆蛋白外渗[29]。因此认为MMP-9的早期表达和激活与早期BBB的破坏有关。脑梗死后,BBB经历了早期的短时间可逆性开放和迟发性的严重破坏,早期BBB的开放与内皮吞噬功能增强等因素有关，主要涉及MMP-2，短时间内可恢复正常。迟发的BBB开放和破坏可持续几天,其在MMP-9在脑组织和血中显著升高起了主导作用。由于MMP-9几乎可以降解所有细胞外基质,并可作为凋亡信号诱导血管内皮细胞凋亡，故其活性升高势必导致微血管及BBB结构的破坏。

　　3.3 MMPs与缺血再灌注损伤

　　有研究发现脑缺血再灌注损伤(cerebral ischemia reperfusion injury, CIRI)后缺血周边区血管内皮细胞、中性粒细胞内可检测到MMP-9表达，且MMP-9的表达与BBB的通透性增加一致[30]。多项动物实验和临床研究中发现，脑缺血及再灌注损伤可诱导MMPs的表达，尤其是MMP-9、MMP-2活性增加[2]。Horstmann等[29]对50例脑梗死患者血清MMP-2、MMP-9、MMP-3、MMP-13、TIMP-1、TIMP-2和层黏蛋白质量浓度进行了检测，结果显示脑梗死过程中血清MMP-2 、MMP-9 质量浓度明显升高。MMP-9可促进血管内白细胞的渗出,有利于炎性细胞因子的表达,激活的白细胞所产生的MMP-9也可使MMP-9升高,白细胞利用MMP-9进行迁移,并且在局灶性脑梗死起病12～24h直至数天后大量增殖,形成恶性循环。

　　3.4 MMPs与HIE治疗

　　实验数据支持在开发创新疗法方面应该考虑到选择性针对MMP-2和MMP-9的理念。Asahi等研究发现MMP-9 基因剔除大鼠脑缺血后，BBB破裂和白质成分的降解都少于对照组，脑损伤体积也相应减小[31]。Svedin等[32]较早发现在大鼠脑内注射MMP-2可促使BBB开放，他们随后的研究又发现，持续大脑中动脉闭塞模型大鼠在缺血24～48h后脑水肿达到高峰，与脑内MMP-9活性增高时间一致[26]。5d后MMP-2活性较对照组才明显增高。该结果显示MMP-9在继发性脑损伤和血管源性水肿中起重要作用，而MMP-2则参与组织修复。MMP-9基因敲除的小鼠在万努奇(Vannucci)模型所引起的缺氧缺血或中脑动脉闭塞(MCAO)缺血模型所引起的大脑缺血病变均得以改善[31～33]。

　　AG3340(普啉司他)是一种基于氧肟酸盐小分子的明胶降解蛋白酶抑制剂，可作为MMPs抑制剂。在慢性大脑低灌注模型中发现了这种明胶酶抑制的影响。数据显示，AG3340在大脑组织受到损伤之前对成年大鼠和小鼠提供着神经保护作用。重要的是，降低星形胶质细胞和小胶质细胞的活性与BBB的完整性相关[34]。

　　在小鼠MCAO脑缺血模型中，明胶酶选择性与SB-3CT结合在损伤后2或6 h，但不超过10 h时可以减少梗死面积[35]。另一项小鼠MCAO模型研究表明，使用广谱MMP抑制剂GM6001，每日一次，治疗10 d后可以抑制神经祖细胞的迁移[36]。尽管其机制尚不明确，然而研究表明抑制MMP活性可以阻止神经可塑性和修复所必须的细胞外基质的蛋白裂解，同时抑制MMPs可以通过减少加工MCP趋化因子和SDF-1α以减少趋化因子信号，从而减少祖细胞迁移[37]。

　　另外需要考虑到MMP在少突胶质细胞增殖和成熟关键时期的作用，特别对MMP-9的抑制和髓鞘形成有潜在影响。有证据表明，MMP抑制剂如果在适当的时间选择性使用是非常有效的治疗方法[38]。

　　3.5 MMPs与HIE预后判断

　　MMPs，特别是MMP-9表达水平高低可作为预测HIE预后的一个重要指标，血清MMP-9不仅是脑损伤程度有关的炎性标志物，对判断HIE严重程度和近期预后有一定意义[14]。既往研究也发现MMP-2的表达水平在缺血2～5 d后开始逐渐升高，持续时间较长，可达数月[39]，表明MMP-2表达水平主要与缺血后损伤修复有关。

　　总之，MMPs，特别是MMP-9和MMP-2在神经系统的生理与病理过程起着重要作用，其作用机制尚需进一步研究加以阐明。

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