骨桥蛋白与血管再狭窄

　　作者：邱志兵,陈鑫,万松　　作者单位：南京医科大学附属南京第一医院南京市心血管病研究所心胸外科，江苏 南京 210006;香港中文大学威尔斯亲王医院心胸外科

　　【摘要】 骨桥蛋白(OPN)是细胞外基质中一种重要的功能性蛋白，研究表明OPN在血管损伤后新生内膜中的表达明显上调，而且它能促进血管平滑肌细胞、外膜细胞的迁移，被认为是血管损伤修复过程中重要的始动因素，参与血管再狭窄形成，在动脉粥样硬化、血管再狭窄及动脉钙化发生过程中起着重要作用，应用骨桥蛋白及其抑制剂可能有助于血管再狭窄的防治。

　　【关键词】 骨桥蛋白,冠状动脉再狭窄,血管内膜

　　骨桥蛋白(osteopontin,OPN)是细胞外基质中一种重要的功能性蛋白，因其介导骨细胞与骨基质的连接、参与骨基质矿化和重吸收过程而得名。但在巨噬细胞、内皮细胞(EC)、平滑肌细胞(VSMC)及上皮细胞等也有表达。作为一种新型的细胞因于，骨桥蛋白参与多种生命现象，如骨代谢、肿瘤的生长转移、炎症与免疫等，尤其在组织的损伤与修复中受到广泛的关注。近年来的研究表明OPN在血管损伤后新生内膜中的表达明显上调，而且它能促进血管平滑肌细胞。外膜细胞的迁移，被认为是血管损伤修复过程中重要的始动因素[1]。本文对OPN的基本性征以及它在血管再狭窄中的作用进行综述。

　　1 OPN的分子生物学特点与生理功能

　　骨桥蛋白是一种相对分子量约为44×103的分泌型糖基化磷蛋白，约含300个氨基酸残基。氨基酸序列分析显示，骨桥蛋白分子含有1个RGD(Arg-Gly-Asp)细胞结合序列、1个钙离子结合体点和2个肝素结合区。其小RGD序列是骨桥蛋白分于发挥粘附功能的结构基础，具有高度保守性，如果变异或缺失，将丧失促粘附功能。研究揭示，骨桥蛋白氨基端区域与外分泌有关，羧基端区域参与粘附功能[2]。OPN作为细胞信号分子，通过RGD序列与整合素家族中αvβ3、αvβ1和αvβ5结合，在细胞外基质和细胞粘附过程中起重要作用。其中αvβ3是OPN的主要受体，微环境中Ca2+浓度影响OPN与其受体的结合。OPN与整合素αvβ3相互作用是钙依赖性的配体与受体的相互作用，这种作用反过来又能影响细胞内Ca2+水平，对细胞的生理活动产生影响。另外，骨桥蛋白还有一个有意义的结构特征是：在RGD序列附近区域(离RGD序列仅有6个氨基酸残基)存在凝血酶裂解位点，能被凝血酶裂解成大小不同的一个氨基末端片段和一个羧基末端片段。有文献研究表明，裂解后含RGD序列的OPN片段，其促粘附功能比完整的骨桥蛋白分子更强[3]，这可能是机体对骨桥蛋白功能的一种自然生理调节。骨桥蛋白作为一种基质功能性非胶原蛋白，主要通过两种机制发挥细胞信号分子的作用。一是以分子内RGD基元与整合素家族分子结合;二是与细胞表面粘附性糖蛋白CD44以非RGD依赖方式结合。两种作用方式均通过激活细胞内特异性信号传导系统而介导细胞粘附、迁移和增殖。

　　2 血管再狭窄的病理特征

　　血管再狭窄的病理过程现已基本明确，包括急性期的血栓形成和血管弹性回缩，中晚期的内膜增生和血管重塑。90年代早期，由动脉肌层增殖、迁移和基质沉积引起的内膜增生被认为是影响再狭窄的关键因素，但随后人们又发现，动脉损伤后管腔面积的丢失程度大于内膜增生单独的作用，并且前者与内弹力膜面积的减少关系更为密切，这定义为外膜源性血管重塑，其机制及细胞学行为与内膜增生相似[4]。现在普遍认为，晚期管腔面积的丢失是内膜增生和血管重塑两者共同作用的结果。

　　血管重塑是指血管直径的变化或血管膜结构的改变，即血管腔/壁比例和几何形状的改变，其病理改变并不十分清楚。现有资料表明，重塑是由血流动力学(血流，血管壁张力，剪切力)和体液因素(细胞因子，血管活性物质)的改变而触发的。这些因素影响到内皮并传递到邻近的细胞，最后引起一些物质的合成或激活，从而影响细胞生长、凋亡、迁移和细胞外基质成分的改变[5]。连接组织并支撑血管壁的细胞外基质对重塑过程起控制作用，基质金属蛋白酶通过对基质成分的选择性降解来调节细胞外基质的成分组成，可能在重塑反应中起重要作用;重塑过程中外膜可能起主导作用，而早期改变可能发生在中膜，中膜变薄似乎是动脉粥样硬化病变的早期和重要发现[6]。新生内膜增生和血管重塑的方向是决定管腔狭窄严重程度的两个重要因素。

　　3 OPN在心血管系统中的表达

　　Giachelli在克隆新生内膜生成有关基因时发现一种上调基因2B2，经测序发现其为OPN，首次揭示了其在心血管病的可能作用[1];随后在动脉粥样硬化、PTCA术后再狭窄、高血压等引起的血管重塑发病过程中也证实了它的存在。在心血管系统，OPN的来源为内皮细胞(EC)、血管平滑肌细胞(VSMC)、巨噬细胞，VSMC。EC与OPN的相互作用依赖于RGD和Ca2+，在体外培养中，血管成纤维细胞在细胞因子、激素等作用下，可大量分泌OPN。有资料显示，在一系列参与动脉粥样硬化和血管成形术后再狭窄的细胞因子中，PDGF、bFGF、EGF、TGF β、IL-1、AngⅡ均能够刺激血管内皮细胞和平滑肌细胞过度表达骨桥蛋白。原位杂交免疫组织化学和Western印迹检测结果显示，不仅粥样硬化和再狭窄病变部位的内皮细胞和平滑肌细胞内骨桥蛋白mRNA是高表达状态[7]，而且细胞外基质中的骨桥蛋白含量也明显升高。

　　4 OPN参与新生内膜的形成

　　骨桥蛋白在正常血管壁中几乎不表达，但在病理损伤如动脉粥样硬化和血管成形术后再狭窄患者血管中，其表达显著增加。动脉粥样硬化患者的VSMC和新生内膜中，OPN mRNA和蛋白水平比正常人显著升高。Giachelli最早提出OPN可能参与新生内膜生成，并可作为VSMC激活的标志，损伤后2～7 d，VSMC中OPN mRNA及蛋白表达增高;损伤4周后，平滑肌细胞迁移降至最低，内膜增厚明显减缓，此时OPN含量也明显减少，说明OPN参与了新生内膜的生成[1]。在动物实验模型中，血管内皮损伤后，内皮细胞与平滑肌细胞内骨桥蛋白mRNA表达迅速上调，8 h后达到高峰，持续14 d后开始下降，6周左右恢复至正常水平，这与新生内膜形成的时程相一致。利用抗OPN抗体通过阻断骨桥蛋白功能，减缓细胞外基质降解而有效抑制血管内膜增生，管腔狭窄程度减轻[8]。用OPN的抗体处理球囊损伤内膜的大鼠，发现与对照组相比，内膜厚度及内膜细胞数目分别减少33%及31%[9]。

　　5 OPN参与血管平滑肌细胞的增生和迁移

　　几乎所有的血管损伤后都可以发现VSMC数量增多，伴或不伴有细胞体积的增大，从而引起血管中层增厚。Gadeau等在分离涉及VSMC G1期的相关基因时，发现了一个与OPN基同完全相似的cDNA克隆，在体外用血清刺激静止相VSMC以及不同细胞周期的VSMC，发现OPN的表达上调与SMC增生有关;他指出在损伤血管中检测到的OPN的表达量增高可以解释SMC的增生;OPN可能对与血管SMC增生相关的病理过程有重要作用[10]。同样，Isoda等发现OPN转基因小鼠的中膜厚度与对照组相比增加73%～94%，且中膜VSMC处于活跃增殖状态[11]，这些都提示OPN可能是影响中膜VSMC增生的一个重要因素。

　　正常情况下，血管中层VSMC呈收缩表型，没有增殖和迁移能力。在一些刺激因素影响下，VSMC可转变为合成表型，向内膜迁移并大量增殖，OPN是VSMC 由收缩表型向合成表型转化的标志性基因。研究证实OPN促进VSMC的迁移具有时间和剂量依赖性，半数有效剂量为35～57 nmol/L，用OPN刺激后VSMC的迁移率增加了29倍，αvβ3整合素的特异性单抗F11可抑制OPN介导的细胞迁移[12]。利用抗骨桥蛋白抗体或抗integrin αvβ3抗体抑制骨桥蛋白的作用则可抑制血管平滑肌细胞的表型转化、迁移和增殖，进而抑制新生内膜的形成[9]。应用特异性短发夹RNA(shRNA)抑制VSNC骨桥蛋白基因表达发现，转染shRNA的细胞中OPN、mRNA、蛋白表达量均明显降低，VSMC的增殖受到明显抑制[13]。

　　6 OPN参与外膜成纤维细胞转化和迁移

　　近年来，以往被认为只起着支持和营养作用的血管外膜在血管损伤中的作用越来越受到重视。有学者研究表明血管损伤后，外膜成纤维细胞(AF)增殖活性明显增强，并进一步地转化为肌成纤维细胞(MF)迁移至内膜，从而参与新生内膜的形成[14]。OPN不仅能促进中膜VSMC迁移，还能促进外膜成纤维细胞的迁移。与VSMC相似的，OPN介导的AF迁移是通过与细胞表面αvβ3整合素受体结合而发挥其作用的，故αvβ3整合素受体的抑制剂能显著抑制OPN介导的AF迁移[15]。近来认为，当内膜损伤后释放多种生长因子，可使AF转化为MF，而MF在细胞内表达OPN并迁移至内膜后分泌OPN，此时OPN可使大量的MF和VSMC迁移至内膜，参与新生内膜的形成。通过反义核酸转染技术运用Transwell观察OPN对外膜AF迁移的作用发现，血管外膜是产生OPN的潜在源泉，OPN对AF的迁移起趋化作用[16]。

　　7 OPN参与动脉粥样硬化及钙质沉积

　　在动脉粥样硬化斑块中巨噬细胞和活化了的淋巴细胞高度表达OPN，促进了脂纹形成和斑块发展，同时OPN也参与了粥样硬化斑块的钙化过程[17]。对8例内膜切除术患者的颈动脉用LF27标记的人OPN进行免疫细胞化学染色，发现在动脉粥样硬化处，阳性染色集中在内膜层，中膜无染色，外膜神经细胞及其它一些散在细胞染色显弱阳性;进一步研究发现染色最强的区域为嗜碱的钙质沉积处。而另两个正常对照组中，各血管层均呈染色阴性，仅在内膜基质中偶尔发现颗粒状染色，可能代表钙或其它细胞外基质沉积的早期病灶[1]，提示OPN在动脉粥样硬化的钙化过程中起一定作用。钙化可导致血管腔内阻塞及动脉功能减退。研究发现，在动脉粥样硬化及再狭窄的钙化区域内，血管内皮细胞、平滑肌细胞、巨噬细胞均高度表达OPN分子，尤以巨噬细胞为甚，这是机体的一种保护性反应。OPN能够抑制动脉钙化的发生，其作用机理是该蛋白可直接与羟磷灰石晶体表面结合，构成一层蛋白衣，阻止羟磷灰石晶体的进一步成长，从而抑制动脉钙化形成[18]。

　　综上所述，血管损伤刺激EC，VSMC释放血管活性物质;其中某些因子可能使EC和SMC中OPN及整合素表达增强，而后者促进了VSMC，AF和MF向内膜的迁移，从而形成新生内膜，而OPN作为Ca2+结合蛋白，在内膜局部的汇集又为钙质沉积奠定了基础。

　　8 展望

　　目前临床上针对血管再狭窄的防治效果并不理想，其原因是再狭窄的形成是多因素、多因子共同参与的复杂过程，故而对这一过程中“最后共同通路”而非“单一通道”进行治疗成为一个具有深远前景的治疗手段。随着研究的深入，骨桥蛋白作为一种机体反应性功能蛋白，参与血管再狭窄形成已经得到许多实验证实，在动脉粥样硬化、血管成形术后再狭窄及动脉钙化发生过程中起重要作用，应用骨桥蛋白及其抑制剂可能有助于血管再狭窄的防治，但目前对骨桥蛋白及其抑制剂的认识及二者在临床应用方面的许多问题尚待进一步深入研究。血管重塑本身是针对血管内机械应力、有害物质等的一种保护机制，矫枉过正才造成管腔狭窄、血管弹性减退等病理性改变。适度阻断OPN的合成，可能为临床上治疗血管再狭窄、动脉粥样硬化及高血压等引起的血管重塑提供新的策略。

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