脑缺血大鼠脑皮层中强啡肽A(113)的经时表达及脑含水量的变化展

　　作者：淑琴, ZHOU An, 郭新奎，WHITE Aaron LAN Jingquan, PIGNATARO Giuseppe2 YANG Tao 作者单位：1. 西安交通大学医学院第二附属医院神经内科，陕西西安 710004; 2. Robert S. Dow Neurobiology Laboratories, Legacy Clinic Research and Technology Center,Portland, OR, USA;3. 西安交通大学医学院第二附属医院小儿外科，陕西西安 710004

　　【摘要】 目的 研究局灶性脑缺血大鼠脑皮层中强啡肽A(113)的经时表达及脑含水量的变化。方法 用线栓法建立大鼠大脑中动脉梗塞模型，用免疫组织化学方法观察脑缺血组大鼠及假手术对照组大鼠缺血侧及非缺血侧脑皮层强啡肽A(113)在脑缺血100min后再灌注4、8、24h的表达及脑含水量的变化。结果 假手术对照组大鼠缺血侧及非缺血侧脑皮层表达强啡肽A(113)的细胞数分别是每高倍镜视野(60.2±5.1)个及(61.1±3.9)个，在脑缺血后再灌注4、8、24h大鼠缺血侧及非缺血侧脑皮层的强啡肽A(113)表达细胞数分别是每高倍镜视野(39.3±6.2)个及(60.3±3.7)个、(41.5±5.8)个及(60.1±3.9)个、(25.2±5.1)个及(59.6±5.9)个;而脑缺血后再灌注4、8、24h的缺血侧含水量逐渐增加。结论 大鼠脑缺血后缺血侧脑皮层的强啡肽A(113)表达逐渐减少而含水量逐渐增加。

　　【关键词】 局灶性脑缺血;强啡肽A(113);大鼠;脑含水量

　　and the cerebral water content after cerebral ischemiaZHAN Shuqin1,2, ZHOU An2, GUO Xinkui3, WHITE Aaron2,

　　LAN Jingquan2, PIGNATARO Giuseppe2, YANG Tao2

　　(1. Department of Neurology, the Second Affiliated Hospital, Medical School of

　　Xian Jiaotong University, Xian 710004, China; 2. Robert S. Dow Neurobiology Laboratories,

　　Legacy Clinic Research and Technology Center, Portland, OR, USA;

　　3. Department of Pediatric Surgery, the Second Affiliated Hospital,

　　Medical School of Xian Jiaotong University, Xian 710004, China)ABSTRACT: Objective To investigate the developing changes of dynorphin A (113) in rat cortex and the cerebral water content after transient focal cerebral ischemia. Methods Using a transient focal cerebral ischemia model in rats, we analyzed the levels of dynorphin A (113) protein in ischemic rat cortex at 4 hour, 8 hour and 24 hour reperfusion after 100 minutes middle cerebral artery occlusion by immunocytochemistry, and compared with those of sham rat cortex. The changes of cerebral water content were also observed in sham rats and in ischemic rats at the same time point as above. Results In sham rats and the rats at 4 hour, 8 hour and 24 hour reperfusion after middle cerebral artery occlusion, the number of cells that expressed dynorphin A (113) in ischemic cortex and nonischemic cortex (the cortex of the opposite side) was 60.2±5.1 and 61.1±3.9, 39.3±6.2 and 60.3±3.7, 41.5±5.8 and 60.1±3.9, 25.2±5.1 and 59.6±5.9, respectively. The cerebral water content increased gradually at 4 hour, 8 hour and 24 hour reperfusion after middle cerebral artery occlusion. Conclusion The number of cells that express dynorphin A (113) in ischemic cortex decreases gradually and cerebral water content increases gradually after transient focal cerebral ischemia.

　　KEY WORDS: transient focal cerebral ischemia; dynorphin A (113); rat; cerebral water content

　　强啡肽(dynorphin, DYN) 是机体中枢神经系统内一类重要的神经递质，广泛分布于脑与脊髓中，强啡肽A(113)是一种含13个氨基酸，在体内具有广泛生物活性的短链多肽。神经保护研究表明，DYNA(113)与中枢神经系统缺血及再灌注损伤后的继发性病理改变密切相关。为观察局灶性脑缺血大鼠脑皮层中DYNA(113)的经时表达及脑含水量的变化，我们进行了此项研究。

　　1 材料与方法

　　1.1 动物及组织准备 用大脑中动脉阻塞(MCAO)的方法建立短暂性局灶性脑缺血模型[1]。雄性SpragueDawley大鼠(体重250～300g)48只，购自Charles River Laboratories，大鼠在含700mL/L一氧化二氮/300mL/L氧的气体中被40mL/L异氟烷麻醉，并以20mL/L异氟烷维持。MCAO组36只，通过引导一根30的丝线进入一侧颈内动脉腔，同时结扎颈外动脉及颈内动脉颅外段制造大脑中动脉阻塞模型，丝线在100min后被撤出并使再灌注达24h，在每个再灌注结束时间点(4、8、24h)，每组各12只大鼠在麻醉状态下被断头取脑，其中6只全脑立即在干冰上冷冻，用冷冻切片机行全脑冠状冻切，切片厚12μm，-80℃保存备用;另6只进行脑含水量的测定。假手术对照组12只，麻醉、血管分离同上，但不行线拴及动脉结扎，余同MCAO组，其中6只全脑用冷冻切片机行冠状冻切，切片厚12μm，-80℃保存备用;另6只进行脑含水量的测定。

　　1.2 免疫组织化学反应步骤 兔抗DYNA(113)免疫血清购自R&D Ab。切片在室温下干燥后，经100mL/L的甲醛溶液固定，在-20℃置于乙醇∶醋酸液(2∶1) 中5min，30mL/L Triton X100中20min，20mL/L羊血清封闭，1∶500的DYNA(113)一抗湿盒内4℃过夜，再用Cy3标记羊抗兔IgG二抗于湿盒内室温下孵育2h，用含4′，6二脒基2苯基吲哚(DAPI)的封固液封片。上述各步骤间均用PBS彻底漂洗，封片后荧光显微镜下观察。以羊血清代替DYNA(113)一抗孵育对照组的切片，结果为阴性。

　　1.3 脑含水量的测定 将大鼠断头取脑，剔除低位脑干及小脑，分离左右半脑，用滤纸吸去脑表面的水分，取各组半侧脑组织装入称量瓶，电子分析天平称取湿重(精确到0.1mg)，然后置于干燥箱内100℃烘24h至恒重后再称干重，按下列公式计算脑含水量[2]：脑含水量(%)=(湿重-干重)/湿重×100%

　　1.4 结果分析 在Leica落射荧光显微镜(Leica Microsystems Inc.)下辅以BIOQUANT程序(Bioquant Image Analysis)进行照相、阳性细胞计数，取每高倍镜视野作为一个单位面积，随机记数每张切片缺血侧及对照侧脑皮层各3～5个高倍镜视野内的阳性细胞数，计算每组6只大鼠缺血侧及对照侧脑皮层阳性细胞数所得的平均数即为该组脑皮层表达DYNA(113)的阳性细胞数，各组间差异行方差分析。各组脑含水量亦为每组6只大鼠缺血侧及对照侧半侧脑组织含水量的平均数，各组间脑含水量的差异亦行方差分析。P<0.05为差异有统计学意义。

　　2期〖2〗展淑琴, ZHOU An, 郭新奎，等. 脑缺血大鼠脑皮层中强啡肽A(113)的经时表达及脑含水量的变化

　　2 结 果

　　2.1 DYNA(113)表达的变化 荧光显微镜下观察表达DYNA(113)的阳性细胞胞质呈棕黄色着色，各组表达DYNA(113)的阳性细胞数结果见表1。缺血侧再灌注4、8、24h的脑皮层表达DYNA(113)的阳性细胞数与假手术对照组缺血侧及与同一时间点非缺血侧相比均明显减少，有显著性差异，而非缺血侧再灌注4、8、24h的脑皮层表达DYNA(113)的阳性细胞数与假手术对照组相比无显著性差异(图1)。表1 脑缺血再灌注后不同时间点大鼠脑皮层内表达DYNA(113) 的阳性细胞数

　　2.2 大鼠脑缺血后再灌流4、8、24h脑含水量的变化 缺血侧再灌注8、24h的脑含水量均明显增加，与假手术对照组缺血侧及与同一时间点非缺血侧相比有显著性差异(P<0.05)，而非缺血侧再灌注24h的脑含水量也增加，与假手术对照组非缺血侧及与同一时间点缺血侧相比有显著性差异(P<0.05，表2)。表2 脑缺血再灌注后不同时间点脑含水量的变化

　　3 讨 论

　　脑梗死在脑血管病中最常见，约占75%，其发病急、病情重、致残率和病死率高，严重影响患者的生活质量。近年来在脑梗死的基础研究、治疗领域都有很大的进展，有关内源性阿片肽与脑梗死关系的研究逐渐增多。

　　内源性阿片肽是体内具有阿片样活性的一组物质，包括内啡肽、DYN、脑啡肽、内吗啡肽以及孤啡肽。它们存在于脑组织、脑脊液及血液中，在体内发挥神经递质和激素的功能。它们通过机体不同部位的各种阿片受体起作用，其作用多样化，对机体的心血管功能、内分泌免疫网络的调节以及消化系统、镇痛、呼吸系统等都有重要的调节作用。有研究证实急性脑缺血不同时期脑、脑脊液和血液中内源性阿片肽浓度均发生明显变化，表明内源性阿片肽在缺血性脑损伤的病理生理过程中发挥着重要作用。强啡肽参与中枢神经系统损伤后的继发延迟性病理损害过程，是阿片肽中作用最强的一种[3]。

　　1979年，GOLDSTEIN等从猪垂体中提取了一种阿片样活性极强的17肽DYN，当时只定出其N末端的13个氨基酸，2年后才确定其余的4个氨基酸残基。1982年GOLDSTEIN和UDENFRIEND分别发现另一种13肽DYN，其N末端还经一对碱性氨基酸与上述17肽DYN的C末端相接，命名为DYNB，因而就将先前发现的17肽DYN定名为DYNA。强啡肽除了包括上述DYNA及DYNB外，还包括α新内啡肽，它们在脑和脊髓内有广泛分布, 其功能复杂多样。强啡肽对κ受体选择性强，被认为是κ受体的内源性配体[4]。

　　DYNA(113)是强啡肽家族中具天然活性的成员之一[3]，含13个氨基酸，是内源性κ型阿片受体激动剂[5]，在下丘脑、皮层、海马含量较高，不仅对痛觉、感知和情感有调节作用，而且与脑缺血的发生发展密切相关。近年来实验研究证明DYNA(113)与脑缺血、缺血性脑水肿的形成和发展关系密切。

　　FRIED[6]曾报告蒙古沙土鼠脑缺血时，缺血脑区DYNA(113)含量持续显著地降低。脑创伤后下丘脑、皮层、海马、垂体DYNA(113)在24h内不同时程均有变化，总的趋势是伤后下丘脑、皮层、海马DYNA(113)含量降低，而垂体含量升高，提示DYNA(113)参与了脑创伤后的病理过程[7]。脑梗死急性期患者血浆DYNA(113)含量显著降低，而且梗死体积越大及病情越重者，DYNA(113)含量越低，说明DYNA(113)的减少与缺血性脑损伤的病理生理过程密切相关[8]。

　　本研究在假手术对照组大鼠缺血侧及非缺血侧脑皮层的表达DYNA(113)的细胞数分别是每高倍镜视野(60.2±5.1)个及(61.1±3.9)个，在大鼠脑缺血后再灌注4、8、24h缺血侧的脑皮层表达DYNA(113)的阳性细胞数均明显减少，与假手术对照组缺血侧及与同一时间点非缺血侧相比均有显著性差异(P<0.01)，而非缺血侧再灌注4、8、24h的脑皮层表达DYNA(113)的阳性细胞数与假手术对照组相比无显著性差异;在大鼠脑缺血后再灌注4、8、24h缺血侧的脑含水量逐渐增加，其中再灌注8、24h组缺血侧脑含水量与假手术对照组缺血侧及与同一时间点非缺血侧相比均有显著性差异(P<0.05)。

　　从实验结果看出脑缺血后再灌注4h即出现DYNA(113)表达的减少，且随着再灌注时间的延长，DYNA(113) 的表达进一步减少，而此过程中伴随着脑水肿的进一步加重。推测DYNA(113)可能具有脑保护作用，增加DYNA(113)可能有利于减轻脑水肿。

　　多项研究表明DYNA(113)减轻脑缺血性损伤，产生明显的神经保护作用[9]。大鼠实验性脑缺血的缺血脑区DYNA(113)含量显著降低，侧脑室注射强啡肽A则脑水肿明显减轻[10 ]。TURNER等[11]在对猫的实验性局灶性脑缺血研究中发现DYNA(113)可通过血脑屏障到达正常猫海马、皮层、小脑，且通过血脑屏障的量较多，这些研究支持对局灶性脑缺血的猫外周给予DYNA(113)可通过中枢机制产生保护作用;且脑缺血的猫以DYNA(113)治疗具有较高的生存率、较少的组织损伤及较轻的脑重量，神经功能有较大的恢复，在脑缺血6h后给予DYNA(113)仍有效，提示κ型阿片受体激动剂DYNA(113)对急性脑缺血治疗的益处[12]。SILVIA等[13]证明DYNA能够明显改善猫脑缺血后的神经机能缺损程度，延长生存时间，减轻脑组织损伤。血浆中的DYNA(113)含量在脑梗塞72h内明显降低，病后第3周其含量升高，与基础研究中缺血性脑水肿的明显时相和消退时相一致，也提示DYNA(113)对于缺血性脑损伤可能具有一定的保护作用[14]。短暂性脑缺血的鼠有明显的记忆障碍，在脑缺血前，脑室注射DYNA(113)可通过激活κ型阿片受体对这种损伤产生潜在的保护作用[5]。在单侧脑缺血沙土鼠模型，DYN治疗可明显改善运动功能障碍[15]。

　　本研究中随着脑缺血再灌注时间的延长，DYNA(113)表达减少的同时伴有脑水肿的加重。KAO等[14]的研究认为DYNA对脑缺血的积极作用主要是对抗脑水肿, 能使缺血后脑重量减少到缺血前水平，提示DYNA(113)可能有一定的临床应用价值。因其对κ受体选择性强，故其保护作用可能是通过κ受体实现的。

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