特发性血小板减少性紫癜与EB病毒感染的关系
发表时间：2010-05-26 浏览次数：427次
作者：卢愿 作者单位：华中科技大学同济医学院附属协和医院儿科，湖北 武汉 430022
【摘要】 目的 探讨特发性血小板减少性紫癜(ITP)与EB病毒(EBV)感染的相互关系。方法 采用血清酶联免疫吸附试验(ELISA)及实时荧光定量聚合酶链反应(FQ-PCR)技术，对68例ITP和14例健康儿童血清EBV衣壳抗原IgM (EBV-CA-IgM)及外周血单核细胞内EBV-DNA进行定量检测，并结合临床进行分析。结果 68例ITP病儿EBV感染30例(44%)，其中EBV-DNA(-)/EBV-IgM(+)24例，EBV-DNA(+)/EBV-IgM(+)6例，EBV-DNA含量每升(4.55±7.19)×108拷贝;6例EBV-DNA(+)病儿血清EBV-CA-IgM阳性5例，另1例EBV-CA-IgM由阴性转为阳性。正常对照组血清EBV-CA-IgM及EBV-DNA均阴性。EBV感染组、EBV-DNA(-)/EBV-IgM(+)组及EBV-DNA(+)/EBV-IgM(+)组与非EBV感染组ITP病儿外周血的白细胞数比较差异有统计学意义(F=5.03,q=3.70~4.49,P<0.01); EBV-DNA(-)/EBV-IgM(+)组与EBV-DNA(+)/EBV-IgM(+)组ITP病儿外周血的白细胞数差异无统计学意义(q=1.45,P>0.05)。非EBV感染ITP存在T淋巴细胞亚群的异常,即CD4+细胞降低,CD8+细胞升高。EBV感染ITP病儿尤其EBV-DNA(+)/EBV-IgM(+)组病儿T淋巴细胞总数亦降低，CD4+细胞降低明显。结论 EBV感染ITP存在T淋巴细胞免疫功能下降及紊乱，应同时进行抗病毒和免疫治疗。其血小板恢复时间长，但预后好。
【关键词】 Epstein-Barr病毒 紫癜 血小板减少性 聚合酶链反应 T淋巴细胞
THE RELATIONSHIP BETWEEN IDIOPATHIC THROMBOCYTOPENIA PURPURA AND EPSTEIN-BARR VIRUS INFECTION LU YUAN, JIN RUN-MING, SUN LI-RONG, et al(Department of Pediatrics, Unoin Hospital, Huazhong University of Science and Technology, Wuhan 430022, China) [ABSTRACT]ObjectiveTo study the correlation between Epstein-Barr Virus (EBV) infection and idiopathic trombocytopenia purpura (ITP). MethodsSerum EBV-CA-IgM and EBV-DNA in peripheral blood mononuclear cells in 68 cases with ITP and 14 healthy children were detected by enzyme linked immunosorbent assay(ELISA) and fluorescence quantitative-polymerase chain reaction (FQ-PCR) and analyzed. ResultsIn 68 ITP, 30 with EBV infection, in which, 24 with EBV-DNA(-)/EBV-IgM(+); six with EBV-DNA(+)/EBV-IgM(+); the content of EBV-DNA was (4.55±7.19)×108 Copy/L; five with both EBV-DNA(+) and EBV-IgM(+) in the beginning, only one with EBV-CA-IgM turned from negative into positive one week later. EBV-CA-IgM and EBV-DNA were not detected in healthy controls. ITP patients with EBV infection had significantly higher incidence of peripheral leukocytosis (P<0.05). The recovery time of platelet in ITP patients with EBV infections was significantly longer than that without EBV infections (P<0.01). The level of CD4 in ITP without EBV infections was lower than that in normal group, while the level of CD8+ was higher; the level of CD4+ in ITP patients with EBV infection, especially in those with both EBV-DNA and EBV-IgM positive, was lower than that in both normal subjects and ITP without EBV infection. ConclusionITP patients with EBV infection have lowered and disordered cellular immunity, a simultaneous antivirus and immunotherapy are necessary. Though the recovery of platelet takes time, its prognosis is good.
[KEY WORDS]Epstein-Barr virus; Purpura, trombocytopenic; Polymerase chain reaction; T lymphocytes
Epstein-Barr病毒(EBV)是一种人类疱疹病毒，它不仅与鼻咽癌、传染性单核细胞增多症、移植后淋巴细胞增生性疾病等密切相关[1~3]，与血液疾病的关系也日益受到重视。为了解特发性血小板减少性紫癜(ITP)并发EBV感染情况及其临床特点，本研究采用血清酶联免疫吸附试验(ELISA)和实时荧光定量聚合酶链反应(FQ-PCR)技术，分别检测了68例ITP病儿和14例健康儿童血清EBV衣壳抗原IgM抗体(EBV-CA-IgM)及外周血单核细胞内EBV-DNA的含量，现将结果报告如下。
1 资料和方法
1.1 一般资料
ITP病儿68例，为青岛大学医学院附属医院小儿血液科2004年1月~2006年12月住院病儿,男32例，女36例;年龄6个月~15岁，中位年龄6岁。ITP诊断参照国际儿童ITP研究组2006年提出的ITP标准：有血小板减少(<150×109/L)和(或)出血表现, 其他方面完全正常并排除其他可以引起血小板减少的疾病[4]。另取14例健康儿童作为正常对照组，其中男8例，女6例;年龄2~10岁，中位年龄6岁。
1.2 检测指标及方法
1.2.1 EBV-CA-IgM 取受检者静脉血2 mL,常规离心15 min后,吸取血清，采用ELISA方法检测。试剂盒由深圳博卡生物有限公司提供。严格按试剂盒说明操作。结果阳性者再用酶标仪(德国,SIGMA 960型)测定吸光度值验证。以EBV-CA-IgM阳性和(或)EBV-CA-IgG阳性(EBV-CA-IgG≥1∶640)或恢复期升高4倍以上,EBV-DNA定量阳性者确定为EBV感染[5];不满足以上条件者为非EBV感染。将EBV感染者又分为EBV-DNA(-)/EBV-IgM(+)及EBV-DNA(+)/EBV-IgM(+)。
1.2.2 EBV-DNA定量 采用FQ-PCR技术。取EDTA抗凝外周血2 mL，用淋巴细胞分离液分离沉淀白细胞，然后加50 μL DNA提取液充分混匀，沸水浴10 min转至4 ℃静置8~12 h以确保病毒颗粒充分裂解。10 000 r/min离心5 min,取上清液2 μL做PCR扩增。按照10 倍梯度稀释EBV-DNA阳性定量标准品,-20 ℃保存。阴性质控品、阳性标准品均来自EBV PCR 荧光检测试剂盒(购自中山大学达安基因股份有限公司)。将处理后样品、阳性标准品(5种浓度)、阴性对照品2 μL加入专用毛细管中，8 000 r/min离心2 min，插入圆形卡盘倒置10 s后进行扩增。循环条件：93 ℃预变性2 min，然后按93 ℃ 5 s，57 ℃ 45 s,共40个循环。反应结束后, 用Roche LightCycler所带SDS 软件计算出未知标本数值。
1.2.3 淋巴细胞亚群 取受试者外周血2 mL经肝素抗凝后，采用流式细胞仪(EPICS-XL 型,美国Coulter公司产品)检测。 异硫氰光荧光素(FITC)标记的CD+3 、CD+4、CD+8、CD+19(B淋巴细胞)单克隆抗体为Coulter公司产品。单抗用全血法按照试剂说明进行标记,即取100 μL抗凝全血加入10 μL以FITC 标记的CD+3、CD+4、CD+8、CD+19及IgG抗体,混匀室温放置15 min后加1 mL红细胞溶解液,轻轻摇荡10 min上机检测。
1.3 临床治疗方案及疗效判断
68例ITP病儿诊断明确即开始给予人血丙种球蛋白1 g/(kg·d)静脉输注，第2～7天隔日查外周血常规了解血小板的回升情况，1周无效者第二次给予丙种球蛋白1 g/(kg·d)静脉输注,每3～5 d复查血常规，直至血小板回升至正常。2周后血小板仍低者，采用泼尼松1.5～2.0 mg/(kg·d)) 常规治疗,1～2周定期门诊复查。并EBV感染者同时加用更昔洛韦5～10 mg/(kg·d),连续治疗2周;并细菌感染者，经验性加用抗生素。临床疗效判定参照文献[4]标准。
1.4 统计学处理
计量资料结果以x±s表示，数据间比较采用方差分析和χ2检验。
2 结 果
2.1 ITP病儿EBV感染情况
ITP病儿检测出EBV-CA-IgM阳性30例(44%)， 其中EBV-DNA(-)/EBV-IgM(+)24例，EBV-DNA(+)/EBV-IgM(+)6例(20%)，EBV-DNA含量为每升(4.55±7.19)×108拷贝;6例EBV-DNA(+)ITP病儿病初血清ELISA检测EBV-CA-IgM阳性5例，另1例为阴性，但1周后复查，EBV-CA-IgM由阴性转为阳性。正常对照组EBV-CA-IgM及EBV-DNA均阴性。
2.2 EBV感染与血常规的关系
EBV感染组与非EBV感染组ITP病儿外周血的血红蛋白含量、血小板含量比较差异无统计学意义(F=0.27、1.18,P>0.05);EBV感染组、EBV-DNA(-)/EBV-IgM(+)组及EBV-DNA(+)/EBV-IgM(+)组与非EBV感染组ITP病儿外周血白细胞数相比，差异有统计学意义(F=5.03,q=3.70~4.49,P<0.01); EBV-DNA(-)/EBV-IgM(+)组与EBV-DNA(+)/EBV-IgM(+)组ITP病儿外周血的白细胞数相比，差异无显著意义(q=1.45,P>0.05)。见表1。
2.3 EBV感染与外周血淋巴细胞亚群的关系
EBV感染组、EBV-DNA(-)/EBV-IgM(+)组、EBV-DNA(+)/EBV-IgM(+)组ITP病儿外周血CD+3细胞与正常对照组比较差异有显著性(F=28.66,q=5.70~8.51,P<0.01)，而非EBV感染组ITP病儿外周血CD+3细胞与正常对照组相比，差异无统计学意义(q=0.19,P>0.05);EBV感染组、EBV-DNA(-)/EBV-IgM(+)组、EBV-DNA(+)/EBV-IgM(+)组与非EBV感染组外周血CD+3细胞相比较差异有统计学意义(q=7.58~10.01,P<0.01);EBV-DNA(-)/EBV-IgM(+)组与EBV-DNA(+)/EBV-IgM(+)组相比差异亦有显著性(q=4.90,P<0.01)。
EBV感染组、EBV-DNA(-)/EBV-IgM(+)组、EBV-DNA(+)/EBV-IgM(+)组及非EBV感染组ITP病儿外周血CD+4细胞与正常对照组相比差异有统计学意义(F=12.45,q=3.67~8.95,P<0.01);EBV感染组、EBV-DNA(-)/EBV-IgM(+)组与非EBV感染组ITP病儿外周血CD+4细胞相比差异有统计学意义(q1=4.07、12.02,P<0.01)，而EBV-DNA(+)/EBV-IgM(+)组与非EBV感染组、EBV-DNA(-)/EBV-IgM(+)组与EBV-DNA(+)/EBV-IgM(+)组外周血CD+4细胞相比差异无统计学意义(P>0.05)。
EBV感染组、EBV-DNA(-)/EBV-IgM(+)组、EBV-DNA(+)/EBV-IgM(+)组ITP病儿外周血CD+8细胞与正常对照组相比差异无统计学意义(F1=8.41、q=0.73~1.84,P>0.05)，而非EBV感染组与正常对照组相比差异则有显著意义(q=6.07,P<0.01);EBV感染组、EBV-DNA(-)/EBV-IgM(+)组与非EBV感染组 ITP病儿外周血CD+8细胞相比差异有统计学意义(q=6.29、6.33,P<0.01);EBV-DNA(-)/EBV-IgM(+)组与EBV-DNA(+)/EBV-IgM(+)组相比差异无统计学意义(q=1.43,P>0.05)。而各组CD+19细胞相比差异无统计学意义(F=0.28,P>0.05)。见表2。
2.4 EBV感染与临床疗效的关系
ITP病儿治疗期间血小板的恢复情况见表3。EBV感染组、EBV-DNA(-)/EBV-IgM(+)组、EBV-DNA(+)/EBV-IgM(+)组与非EBV感染组ITP病儿血小板恢复情况相比，差异有统计学意义(χ2=10.52~20.49,P<0.01)。而EBV-DNA(-)/EBV-IgM(+)组与EBV-DNA(+)/EBV-IgM(+)组相比差异无统计学意义(χ2=1.56,P>0.05)。
3 讨 论
EBV感染在人群中广泛存在，正常个体EBV感染被抗原特异性MHC限制的细胞毒T淋巴细胞反应所控制[6]，故幼儿感染该病毒后多数无明显 表1 ITP病儿外周血常规检测结果表2 ITP病儿外周血淋巴细胞亚群检测结果表3 ITP病儿血小板恢复正常时间比较症状，呈潜伏性,即EBV的DNA或逆转录合成的cDNA以整合形式或环状分子形式存在于细胞中，呈潜伏状态而检测不到完整病毒，因此本研究正常对照组未检出EBV-DNA。当机体免疫功能低下时病毒基因活化，B细胞被激活并转化为浆细胞,产生各种病毒抗体,主要包括EBV-CA-IgM、抗早期抗原抗体、抗核心抗原抗体。初次感染者均可产生EBV-CA-IgM,1～2周达高峰, 4～8周消失。本文病儿均在病程的第5～10天采血，EBV感染率较高(44%)。FQ-PCR检测EBV-DNA可在病程更早期内检测到EBV感染，本文1例手术前行常规检查发现血小板减低，EBV-DNA定量阳性，而EBV-CA-IgM为阴性，1周后转为阳性，表明病程早期EBV-CA-IgM可出现假阴性。
对ITP病儿进行EBV-DNA及 EBV-CA-IgM检测，有助于ITP发病机制探讨及指导临床治疗。本文结果表明，26例EBV-CA-IgM阳性者仅有6例EBV-DNA阳性，其中1例EBV-DNA阳性、EBV-CA-IgM阴性病儿出现血小板减少，表明血小板减少以免疫损伤为主，同时亦存在病毒直接对骨髓造血细胞的抑制及对血小板直接破坏机制[7]。
ITP病儿中T细胞免疫异常是关键[8,9]。本文结果显示，ITP病儿T淋巴细胞亚群异常,CD+4降低,CD+8升高。提示并EBV感染ITP病儿T淋巴细胞免疫功能下降及紊乱同时存在。EBV感染致ITP病儿白细胞数明显增加，表明EBV具有有效活化细胞周期，促进细胞大量增殖的作用。EBV感染引起T淋巴细胞亚群异常，Ts通过释放抑制因子抑制B细胞和效应T细胞活化，下调机体免疫功能可能是其发病的关键。T、B淋巴细胞在ITP病儿及并EBV感染ITP病儿体内相互作用机制有待于进一步研究。目前治疗主要针对异常的免疫功能。EBV感染ITP病儿血小板恢复时间长，人血丙种球蛋白治疗效果差,可能与机体免疫及病毒双重作用有关。因此，治疗时应针对异常的T细胞免疫功能及抗病毒同时进行。IRIS等[10]认为ITP病儿很少发生严重出血,本组ITP病儿亦如此，且恢复良好。
【参考文献】
[1] PETERSON M R, EMERY S C, YUNG G L, et al. Epstein-Barr virus-associated post-trasplatation lymphoproliferative disorder following lung transplantation is more commonly of host origin[J]. Arch Pathol Lab Med, 2006,130(2):176-180.
[2] 张明. 传染性单核细胞增多症分析[J]. 医药论坛杂志, 2004,25(20):51.
[3] YOUNG L S, RICKINSON A B. Epstein-Barr virus:40 years on[J]. Nat Rev Cancer, 2004,4(10):757-768.
[4] IMBACH P. Development and research in idiopathic thrombocytopenic purpura: an inflammatory and autoimmune disorder[J]. Pediatr Blood Cancer, 2006,47(5 Suppl):S685-S686.
[5] 吴葆菁,李天益,张玉兰,等. 小儿EB病毒感染相关疾病研究[J]. 临床儿科杂志, 2003,21(8):455.
[6] RICKINSON A B, LEE S P, STEVEN N M. Cytotoxic T lymphocyte responses to Epstein-Barr virus[J]. Curr Opin Immunol, 1996,8(4):492-497.
[7] 宋爱琴,董增义,庞秀英,等. HBV感染并发ITP病儿临床特征分析[J]. 齐鲁医学杂志, 2006,21(2):103-105.
[8] CINES D B, BUSSEL J B. How I treat idiopathic thrombocytopenic purpura (ITP)[J]. Blood, 2005,106(7):2244-2251.
[9] CINES D B, MCMILLAN R. Management of adult idiopathic thrombocytopenic purpura[J]. Annu Rev Med, 2005,56:425-442.
[10]IRIS T R, JUKKA R A, BERNWARD Z E, et al. Initial management of children with newly diagnosed idiopathic thrombocytopenic purpura in the Nordic countries[J]. Acta Pediat, 2006,95(6):726-731.
