系膜增生性肾小球肾炎患儿Bax蛋白表达与外周血淋巴细胞凋亡的关系

　　作者：赵彤,卢思广 作者单位：徐州医学院附属医院儿科，江苏徐州221002)

　　【摘要】 目的 明确病理类型为系膜增生性肾小球肾炎(mesangial proliferative glomerulonephritis，MsPGN)的原发性肾病综合征(nephrotic syndrome，NS) 患儿外周血淋巴细胞(peripheral blood lymphocytes，PBLs)Bax蛋白的表达与PBLs凋亡的关系。探讨MsPGN-NS患儿糖皮质激素(glucocorticoid，GC)抵抗的部分机制。方法 所有患儿和正常儿童均于清晨空腹条件下采取静脉血，以密度梯度离心法分离PBLs，所得细胞用植物血凝素(phytohemagglutinin，PHA)或PHA+1×10-6mol/L地塞米松(dexamethasone，Dex)处理，培养24 h和48 h后应用流式细胞仪检测Bax蛋白的表达及细胞凋亡率。 结果 ①MsPGN-NS患儿与正常儿童Dex组PBLs Bax蛋白表达量均显著高于空白对照组(P<0.01)，且呈时间依赖性(48 h>24 h)，但各时间点MsPGN-NS患儿Dex组Bax的表达均低于正常儿童相应组(P<0.01);②MsPGN-NS患儿与正常儿童Dex组PBLs凋亡率均高于空白对照组(P<0.01)，且呈时间依赖性(48 h>24 h)，但各时间点MsPGN-NS患儿Dex组细胞凋亡率均低于正常儿童组(P<0.01)。结论 MsPGN-NS患儿PBLs Bax蛋白表达水平与PBLs凋亡率呈明显正相关，但其表达显著低于正常对照组，提示Bax蛋白的低表达是导致MsPGN-NS患儿PBLs凋亡减少，进而造成GC抵抗的原因之一。

　　【关键词】 系膜增生性肾小球肾炎;肾病综合征;外周血淋巴细胞;Bax;凋亡

　　The relationship between expression of Bax protein and apoptosis in peripheralblood lymphocytes in children with mesangial proliferativeglomerulonephritisZHAO Tong, LU Siguang(Department of Pediatrics, Affiliated Hospital of Xuzhou Medical Collage, Xuzhou, Jiangsu 221002, China)Abstract： Ojective To investigate the relationship between expression of Bax protein and apoptosis in peripheral blood lymphocytes (PBLs) in children with primary nephrotic syndrome (NS) with the pathology type of mesangial proliferative glomerulonephritis (MsPGN), so to further explore the mechanism of glucocorticoid-resistance in children. Methods The PBLs in MsPGN-NS and normal children were isolated with Ficoll-Hypaque gradient centrifugation. Then they were treated with phytohemagglutinin (PHA) or PHA plus dexamethasone (Dex). At the 24th and 48th hour of culture, the expression levels of Bax protein and apoptosis proportion were measured by flow cytometric analysis. Results The Bax protein levels in PBLs of Dex in the control group were much higher than those in both the MsPGN-NS group and normal children (P<0.01) in a time-dependence manner (48 h>24 h). However, at each time point the Bax protein levels of Dex group in MsPGN-NS children were all lower than those in normal children (P<0.01). The apoptosis proportions of PBLs remarkably increased after Dex treatment in both MsPGN-NS and normal children (P<0.01), also in a time-dependence manner. But at each time point the apoptosis proportions of Dex group in MsPGN-NS children were all lower than those in normal children (P<0.01). Conclusion In PBLs of MsPGN-NS children the expression of Bax protein has positive correlation with apoptosis proportions, but at a level significantly lower than in the normal control group. The low expression of Bax protein probably accounts for the decreasing apoptosis proportions of PBLs, which leads to glucocorticoid-resistance in children with MsPGN-NS.

　　Key words：mesangial proliferative glomerulonephritis (MsPGN); nephrotic syndrome; peripheral blood lymphocytes (PBLs); Bax; apoptosis已换

　　糖皮质激素(glucocorticoid，GC)是治疗肾病综合征(nephrotic syndrome，NS)的首选药物，但临床上部分NS患儿由于对GC抵抗，致使反复应用GC和免疫抑制剂，从而出现很多药物不良反应和(或)并发症，加重了原有的病理损害。因此NS患儿GC抵抗的原因一直是研究的热点[1-5]。系膜增生性肾小球肾炎(mesangial proliferative glomerulonephritis，MsPGN)是儿童原发性NS较常见的病理类型之一，也是最常见的对GC不敏感的病理类型，临床治疗较为困难。免疫功能紊乱可能在MsPGN患儿发病机制中起着重要作用。本实验采用Bax蛋白表达及外周血淋巴细胞(PBLs)凋亡率来观察系膜增生型NS中GC抵抗的可能机制。

　　1 资料和方法

　　1.1 研究对象 本实验所选患者为门诊随访和定期住院进行环磷酰胺冲击治疗(3个月和半年一次)的原发性NS患儿，他们均是初治时对GC不敏感，而行肾活检术，病理类型证实为MsPGN,36例，其中男23例，女13例，平均年龄10.6岁，所有入选儿童近期无感染性疾病，部分患儿已停用GC 3个月以上或现口服强的松最大量为5 mg，隔日1次。正常儿童(无感染性疾病、变态反应性疾病、外伤等)30例，男18例，女12例，平均年龄11.6岁。于2004年8月—2005年2月采血，检测地塞米松(Dex)处理不同时间(24 h、48 h)后Bax蛋白表达水平与PBLs凋亡情况。

　　1.2 试剂 小鼠抗人Bax单抗购自北京莱博生物技术研究所;AnnexinⅤ/PI凋亡检测试剂盒购自北京宝赛生物技术有限公司;RPMI1640、植物血凝素(PHA)、新生牛血清、地塞米松等均为北京华美生物工程公司进口分装。

　　1.3 主要仪器 二氧化碳培养箱为美国UVP公司产品，流式细胞仪(FCM)由美国Calibur公司生产。

　　1.4 方法

　　1.4.1 淋巴细胞分离与培养 密度梯度离心法常规分离淋巴细胞，调备细胞数为1×109/L，用含10%小牛血清和双抗的RPMI1640完全培养基分组进行细胞培养。对照组为细胞悬液+PHA，处理组为细胞悬液+PHA+Dex，置37℃、5%CO2饱和湿度培养箱中培养24～48 h。

　　1.4.2 Bax蛋白表达的检测 取PBS调备的浓度为1×109/L的细胞悬液1 ml，用4%多聚甲醛固定15～20 min，1000 r/min离心10 min, 弃上清，沉淀用含0.1%Triton100和10%小牛血清的完全培养基洗涤1次，条件为1000 r/min离心10 min，而后加入Bax单抗(浓度均为1∶100)100 μl，混匀后室温放置30 min，完全培养基洗涤2次，加入FITC-山羊抗鼠IgG(浓度为1∶100)100 μl，混匀后室温避光放置30 min，完全培养基洗涤2次;沉淀用完全培养基0.5 ml重悬，送流式细胞仪检测。

　　1.4.3 淋巴细胞凋亡的检测 取PBS调备的浓度为1×109/L的细胞悬液1 ml,1 000r/min、4℃离心10 min，弃上清，加入1 ml冷的PBS，轻轻震荡，使细胞悬浮，1000 r/min、4℃离心10 min，弃上清，再用冷PBS洗涤2次;将细胞重悬于200 μl结合缓冲液，加入10 μl AnnexinⅤ-FITC和5 μl PI，轻轻混匀，避光室温反应15 min、4℃反应30 min，加入300 μl结合缓冲液，1 h内上机检测。

　　1.5 统计学处理 所有数据用SPSS 11.5统计软件进行分析，Bax蛋白表达水平以及凋亡率均以±s表示，两组之间的比较用t检验，Bax蛋白表达量与凋亡率之间的关系应用相关分析，P<0.05为有显著性差异。

　　2 结 果

　　2.1 MsPGN-NS患儿与正常儿童PBLs Bax蛋白的表达 ①MsPGN-NS患儿与正常儿童空白对照组PBLs经体外培养24和48 h后Bax的表达有所升高，Dex组Bax的表达则显著增加(48 h>24 h);Dex组各时间点Bax蛋白的表达均显著高于空白对照组(P<0.01);②MsPGN-NS患儿空白对照组Bax蛋白的表达与正常儿童相比无明显差异(P>0.05)，而Dex组Bax蛋白的表达则显著低于正常儿童(P<0.01)。见表1。

　　2.2 MsPGN-NS患儿与正常儿童PBLs凋亡率 ①MsPGN-NS患儿与正常儿童空白对照组PBLs经体外培养24和48 h后凋亡率有所升高，Dex组凋亡率则显著增加(P<0.01)，并与处理时间呈正相关(48 h>24 h);Dex组各时间点凋亡率均显著高于空白对照组(P<0.01);②MsPGN-NS患儿空白对照组24 h凋亡率略低于正常儿童,但无明显差异(P>0.05)，而48 h凋亡率明显低于正常儿童(P<0.05);Dex组凋亡率则显著低于正常儿童(P<0.01)。见表2。表1 肾病综合征患儿与正常儿童淋巴细胞Bax蛋白表达的比较(±s,%)

　　地塞米松

　　作用时间肾病综合征患儿组(n=36)对照组Dex组 正常儿童对照组表2 肾病综合征患儿与正常儿童淋巴细胞凋亡百分比的比较与组内对照组比较：△P<0.01;与正常儿童Dex组比较：*P<0.01;与同组24 h比较：#P<0.01

　　2.3 MsPGN-NS患儿与正常儿童PBLs凋亡率与Bax蛋白表达的相关性分析 MsPGN-NS患儿与正常儿童PBLs凋亡率与Bax蛋白的表达水平均呈明显正相关(P<0.01)，即Bax蛋白表达越高，细胞凋亡率越高，反之亦然，见表3。表3 NS患儿外周血淋巴细胞Bax蛋白表达水平与凋亡率的相关性分析△P<0.01

　　3 讨 论

　　NS是一种免疫相关性疾病，按病理类型可分为微小病变和非微小病变2种类型。GC目前是治疗NS的首选药物，然而MsPGN-NS患儿大多表现为GC不敏感或耐药，病情容易迁延反复。至今对于MsPGN-NS患儿GC治疗的反应差异性仍没有比较满意的解释。研究发现，不同病理类型的GC抵抗型NS患儿几乎都存在PBLs凋亡受抑的情况。因此，本研究选择MsPGN的GC抵抗型NS患儿为研究对象，以炎症-免疫性疾病发病中淋巴细胞过度活化、增殖及凋亡不足等一系列免疫失衡机制为理论基础，探讨MsPGN-NS患儿GC抵抗的部分可能机制。

　　我们采用AnnexinⅤ/PI双染法，流式细胞仪检测细胞凋亡，此法的优点是既可以检测早期凋亡，又可将凋亡和坏死区分开来，较PI单染法具有更高的灵敏性和特异性，提高了实验结果的可信度。研究结果显示：MsPGN-NS患儿与正常儿童相比，体外培养淋巴细胞的自然凋亡率24 h无明显差异(P>0.05)，而48 h MsPGN-NS患儿则低于正常儿童，差异有统计学意义(P<0.01); MsPGN-NS患儿与正常儿童Dex组PBLs凋亡率均高于空白对照组(P<0.01)，且呈时间依赖性(48 h>24 h)，各时间点MsPGN-NS患儿Dex组凋亡率均低于正常儿童组(P<0.01)。

　　Bax是Bcl-2基因家族中重要的凋亡调控基因,也是Bcl-2家族中研究最广泛的促凋亡蛋白。Bax定位于细胞质,作用于线粒体， Bax蛋白本身可以形成同二聚体,也可与Bcl-2、Bcl-Xl蛋白等形成异二聚体，对细胞凋亡起促进作用。Bax和 Bcl-2蛋白的比例决定了细胞接受凋亡信号后的命运，当Bax蛋白占优势时细胞发生凋亡,反之当Bcl-2蛋白表达增强时细胞继续生存。

　　Bax在免疫系统发育与免疫调节中起着重要作用。许多自身免疫性疾病的发生都与Bax有关。Ogawa等[6]对干燥综合征患者淋巴细胞凋亡与凋亡相关基因表达的研究结果表明干燥综合征患者PBLs体外培养后T淋巴细胞凋亡数显著增加，并且发现这与Bax表达增加、Bcl-2表达减少有关。崔玉芳等[7]用γ射线照射小鼠，观察照射不同时间小鼠PBLs凋亡情况，从而探讨其发生机制，结果发现照射早期小鼠PBLs凋亡率显著升高，PBLs Bax蛋白表达水平也明显增加，而后期随着凋亡率的降低，Bax蛋白的表达也明显下降。其他免疫相关性疾病如系统性红斑狼疮、B细胞淋巴瘤、骨髓异常增生综合征等淋巴细胞凋亡也与Bax表达水平有关。

　　本研究结果显示：Dex可使MsPGN-NS患儿与正常儿童PHA刺激活化的PBLs Bax蛋白表达增加，与同一时间点空白对照组的自然表达相比有明显差异(P<0.01)，且呈时间依赖性(48 h>24 h)，说明GC可诱导人PBLs Bax蛋白的表达。比较MsPGN-NS患儿与正常儿童Bax蛋白的表达，我们发现空白对照组各时间点Bax蛋白的表达无明显差异(P>0.05)，但Dex组各时间点MsPGN-NS患儿Bax的表达均低于正常儿童(P<0.01)。结果提示：MsPGN-NS患儿与正常儿童PBLs经Dex处理后凋亡率明显增加，同时伴随Bax蛋白的表达水平显著提高，证实了Bax与淋巴细胞凋亡之间存在相关关系(r=0.75～0.84)，并且Bax是促凋亡的相关蛋白之一。然而MsPGN-NS患儿经Dex处理后各时间点PBLs Bax蛋白的表达水平及凋亡率均低于正常儿童，说明MsPGN-NS患儿PBLs对GC不敏感与Bax低表达有一定关系，这可能是MsPGN-NS患儿糖皮质激素抵抗的原因之一。

　　综上所述，我们通过对MsPGN-NS患儿和正常儿童PBLs Bax蛋白的表达水平与凋亡率进行检测，结果表明MsPGN-NS患儿存在PBLs凋亡受抑的情况，这与MsPGN-NS患儿Bax蛋白低表达有一定关系。提示Bax蛋白低表达是MsPGN-NS患儿GC抵抗的可能因素之一。

　　【参考文献】

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　　[4] Boussiotis VA, Lee BJ, Freeman GJ, et al. Induction of T cell clonal anergy results in resistance, whereas CD28-mediated costimulation primes for susceptibility to Fas- and Bax-mediated programmed cell death [J]. J Immunol，1997，159(7):3156-3167.

　　[5] Wiley RE, Cwiartka M, Alvarez D, et al. Transient corticosteroid treatment permanently amplifies the Th2 response in a murine model of asthma [J]. J Immunol，2004，172(8):4995-5005.

　　[6] Ogawa N,Dang H,Kong L,et al.Lymphocyte apoptosis and apoptosis-associated gene expression in Sjgren′s syndrome [J]. Arthritis Rheum，1996，39(11):1875-1885.

　　[7] 崔玉芳，高亚兵，杨红，等.　辐射引起的小鼠外周血淋巴细胞凋亡及其机理[J].细胞与分子免疫学杂志,1998,14(4):278-281.