纤维蛋白原β455G/A基因多态性与冠心病的相关性

　　作者：里震,包进　　作者单位：通化市东昌区人民医院，吉林 通化 134002

　　【关键词】 聚合酶链反应,限制片段长度多态性,纤维蛋白原,基因,多态性;冠心病

　　自1987年国外学者首次报道了纤维蛋白原 (fibringeon,Fg)基因多态性可能影响血浆Fg水平以来,Fg基因多态性与冠心病的关系也越来越受到人们的关注。本研究采用聚合酶链反应限制片段长度多态性(PCRRFLQ)技术对86例冠心病患者和 78例年龄、性别相匹配的健康人进行Fg β455G/A基因多态性分析。

　　1 对象与方法

　　1.1 对象

　　观察组病人来自我院内科住院的冠心病患者86例,男48例，女38例,年龄(65.8±5.6)岁。均符合 1979年WHO颁布的缺血性心脏病的命名及诊断标准、1980年我国冠心病诊断标准中的“补充说明”。对照组系我院健康体检者78例，男45例,女33例，年龄(65.3±7.4)岁，经常规检查均无高血压、冠心病及脑卒中等心脑血管病史，休息时心电图正常、体力活动时无心肌缺血症状。全部研究对象均来自吉林地区汉族人群。

　　1.2 临床资料的收集

　　观察组及对照组所有患者近1 w未使用抗凝及溶栓药物，取清晨空腹外周静脉血1 ml与0.109 mol/L枸橼酸钠按9∶1体积抗凝检测血浆Fg浓度;取2%EDTA抗凝血2 ml，抽提DNA。

　　1.3 基因组DNA的提取用普通酚

　　氯仿抽提法，TE溶解后置 4℃保存。

　　1.4 引物

　　参照文献〔1〕等方法设计，序列如下：上游引物5′ATAGAATAGGGTATGAATTTG3′，下游引物5′GGCTGAACCATTTTATCATTT3′。

　　1.5 PCR扩增体系

　　总体积25 μl,PCR扩增条件为94℃预变性4 min，94℃变性30 s，50℃退火30 s，68℃延伸30 s。进行30个循环周期，终末68℃延伸7 min。取10 μl PCR产物，加2 μl的6×上样缓冲液，溴化乙锭(0.5 μg/ml)染色，电压80 V，电泳40 min。以100 bp ladder marker为分子量标准，在紫外分光光度计下观察结果，扩增产物为一条446 bp片段。

　　1.6 酶切体系

　　反应产物应用限制性内切酶HaeⅢ，37℃酶切1 h。酶切产物的多态性通过2%琼脂糖凝胶电泳进行，10 μl酶切产物，加2 μl的6×上样缓冲液，溴化乙锭(0.5 μg/ml)染色，电压80 V，电泳40 min。以100 bp ladder marker为分子量标准，在紫外分光光度计下观察结果并拍照。

　　1.7 统计学方法

　　采用直接记数法计算基因型和等位基因频率，两组间差异比较采用χ2检验。观察组与对照组之间进行逐个等位基因的比较，以相对危险度(OR)计算。

　　2 结 果

　　2.1 血浆Fg

　　观察组血浆Fg水平〔(3.51±0.63) g/L〕明显高于对照组血浆Fg水平〔(2.93±0.48) g/L〕(P<0.001)。

　　2.2 β455G/A基因PCR产物分析

　　根据PCR片段的大小判断Fg β455基因多态性，A等位基因仅有一条446 bp片段，G等位基因酶切为348、98 bp两个片段。A/A型纯合子仅有一条446 bp片段，G/G型纯合子有348、98 bp两条片段，G/A型杂合子有446、348、98 bp三条片段(见图1)。

　　2.3 Fg β455基因型与等位基因频率分布

　　2.4 各基因型发病的OR比较

　　GG型发病OR为0.36，GA型发病的OR为1.87;AA型发病的OR为5.57。

　　3 讨 论

　　Fg主要由肝细胞合成和分泌，肺泡上皮也有合成，是人体凝血系统的重要成分之一。Fg不但参与凝血、血小板聚集和纤溶过程，同时又是血液凝固的底物，当内外凝血系统被启动，激活凝血酶原使变成为凝血酶后，凝血酶使Fg水解掉A和B两个小片段变成纤维蛋白，这是血液凝固反应的中心环节。在某些病理条件下，血管内血栓，以及组织损伤部位产生止血性血栓的过程均是Fg转变成纤维蛋白的过程，随之发生的纤溶作用能使已形成的血栓溶解，有利于组织损伤的修复和动脉血管血运的重建。凝血和纤溶系统一旦失衡均会导致出血和血栓性疾病的发生〔2〕。Fg不仅是关键的凝血因子之一，而且Fg、纤维蛋白及其降解产物可在动脉粥样硬化性斑块处聚集，因而对于血液流变，血管平滑肌的增殖，内皮细胞功能及动脉粥样硬化的形成和发展也具重要作用。近年来，中外学者对血浆Fg水平对血栓性心脑血管病的影响及心脑血管病中血浆Fg水平的变化研究较多，认为血浆Fg水平升高是缺血性心脑血管病形成和发展的关键因素之一〔3〕。

　　基因多态性造成病人反应敏感性的个体差异。个体Fg分泌水平受遗传因素的影响。现在一般认为，Fg基因多态性是导致个体间血浆Fg水平差异的独立因素之一〔4〕。Fg基因位于常染色体4q234q32，核苷酸长度不到50 kb。Fg的基因序列含有众多变异，从而产生个体间限制性内切酶酶切位点的不同,为限制性片断长度多态分析提供了可能。越来越多的流行病学资料表明,Fg与冠心病的发生发展密切相关。本研究发现，观察组A等位基因频率及GA、AA基因型高于对照组。说明这种依赖Fg启动子区基因型的Fg浓度的突然增加，在冠状动脉粥样硬化过程中起了一定作用，而基因改变在其中起着主要的决定作用。HaeⅢ是其中常用的一种分析酶。它的酶切位点位于β纤维蛋白原(Fgβ)基因的5′端，在Fgβ转录起始点上游455碱基处，该处存在GA的变异，称为β纤维蛋白原455G/A基因多态性。在目前的调查中，主要发现的Fg基因多态性有10种。由于Fg三条多态链分别有各自独立转录的mRNA指导下合成的，而Bβ链mRNA的合成是合成Fg整个分子的限速步骤，因此，对Fg表达调控的研究重点集中于Bβ链上。β链上的基因多态性是5′端的β1420，β854，β455(HaeⅢ)，β249(HindⅢ)。由于Fgβ455位点位于5′端上游的启动子区，所以，该位点的基因多态性就成为主要研究对象之一。文献报道认为，Fgβ455 G/A基因与血浆Fg水平升高有关。有流行病学资料表明，β455G/G纯合子与β455G/A杂合子及β455A/A纯合子相比，A/A型个体血浆Fg水平最高，G/A次之，G/G最低。Mannucci等发现-455A携带者比-455G携带者血浆Fg水平增高约20%～30%，另外研究也发现A等位基因与Bβ链转录增高关联〔4〕。

　　目前认为血浆Fg水平升高是Fg缺血性心脑血管病形成和发展的关键因素之一。但结论仍倾向于Fg基因多态性并非直接引起疾病的因素，而是通过影响血浆Fg的水平而发挥作用。这也为冠心病的基因治疗提供了可能。

　　【参考文献】

　　1 Thomas AE,Green FR,Kelleher CH,et al.Variation in the promoter region of the β fibrinogen gene is associated with plasma fibrinogen levels in somoker and nosmokers〔J〕.Thromb Haemost，1991;65:487.

　　2 陈莉，王小林.化学性ARDS肺循环血中纤维蛋白原水平及其临床意义研究〔J〕.中国职业医学，2000;6(2):2478.

　　3 郭杰庭.血浆纤维蛋白原浓度增高并发肺功能减退并增加慢性阻塞性肺疾病的危险性〔J〕.国外医学•呼吸系统分册，2002;3(3):33940.

　　4 Baumann RE，Henschen Ah.Linkage disequilibrium relationships among four polymorphisms within the human fibrinogen gene cluster〔J〕.Hum Genet，1994;94;16570