血管内皮生长因子在儿童血管瘤与血管畸形中的表达研究

作者：王浩生 王艳宁    作者单位：110001 沈阳 中国医科大学（王浩生） 沈阳医学院（王艳宁）　　【摘要】  目的 研究血管内皮生长因子（VEGF）在儿童血管瘤与血管畸形中的表达;为临床辨别血管瘤及血管畸形、指导血管瘤的治疗及检验治疗效果提供客观有效的指标。 方法 采用免疫组化S-P法检测VEGF在血管瘤不同分期、血管畸形、正常血管中的表达情况。 结果 VEGF在血管瘤中有高表达;在增殖期的表达率高于消退早期和消退晚期（P<0.05）;患儿年龄小于等于6岁组的表达率高于年龄大于6岁组（P<0.05）。在血管畸形及正常血管中均未见阳性表达。 结论 VEGF在血管瘤中有高表达，且与其分期及年龄明显有关。

　　【关键词】  血管瘤;血管畸形;VEGF;免疫组织化学

　　血管瘤在婴幼儿即可发生，其在不同部位持续生长可导致视力丧失、容貌异常、气道阻塞等严重的并发症，甚至可以危及生命［1］ 。1982年，Mulliken和Glowacki提出了新的分类标准，认为传统分类的“血管瘤”实为“先天性血管病变”，而其又可分为血管瘤和血管畸形两大类［2］ 。血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）作为血管内皮细胞特异性生长因子，特异性地作用于血管内皮细胞，参与血管瘤的发生和增殖，对于平滑肌细胞和其它类型细胞则无作用［3］ 。为了研究VEGF在血管瘤中的作用，我们利用免疫组织化学方法测定VEGF在血管瘤及血管畸形中的表达情况，进而探讨其在血管瘤增殖、退化过程中的作用及意义。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料    　　1.1.1 研究对象 2000～2005年共58例手术切除标本，均取自沈阳医学院附属医院。其中男31例，女27例，患儿年龄为1个月～13岁，平均5.5岁。按照Mulliken标准［2］ ，将标本分为血管瘤及血管畸形，并将血管瘤标本分为增殖期、消退早期和消退晚期。血管瘤标本共49例，其中增殖期31例，消退早期11例，消退晚期7例;血管畸形为9例，均取自皮肤。另取5例含有正常血管的皮肤标本作为对照。全部标本为10%甲醛固定，石蜡包埋。    　　1.1.2 主要试剂和来源 鼠抗人单克隆抗VEGF抗体、S-P超敏免疫组织化学试剂盒、DAB酶底物显色试剂盒、EDTA均购于福州迈新生物技术公司。    　　1.2 实验方法 免疫组织化学方法检测采用链霉菌素抗生物素蛋白-过氧化物酶免疫组化法（即S-P法）。4μm厚度连续切片，常规脱蜡入水，一抗为鼠抗人单克隆抗VEGF抗体（克隆号JH121），所有操作按照SP试剂盒说明进行。抗原修复采用EDTA抗原修复液热浴修复。DAB染色，苏木素复染。同时用已知阳性片作阳性对照，用PBS代替一抗作阴性对照。    　　1.3 结果判定 每张切片随机选取5个视野，每个视野计数100个细胞，计算阳性细胞的百分比。以血管内皮细胞胞浆出现棕黄色颗粒为阳性表达。按着色细胞百分数记分，小于20%为0分;20%～50%为1分;大于50%为2分。按着色强度记分，无着色为0分;浅棕色为1分;深棕色为2分。将着色细胞百分数记分与着色强度记分相乘，总记分0分为阴性（-）;1～2分为弱阳性（+）;4分为强阳性（++）。    　　1.4 统计学分析 采用SPSS for windows11.5统计分析软件进行分析，对VEGF在血管瘤不同分期中及不同年龄组中的表达采用卡方检验和确切概率法。P<0.05有统计学意义。

　　2 结果     　　2.1 VEGF血管瘤、血管畸形及正常组织中的表达 VEGF定位于血管内皮细胞胞浆，呈棕黄色颗粒。在31例增殖期血管瘤标本中有30例VEGF表达呈阳性，阳性表达率为96.77%;在11例消退早期血管瘤标本中有7例VEGF表达呈阳性，阳性表达率为63.64%;在7例消退晚期血管瘤标本中有4例VEGF表达呈阳性，阳性率为57.14%。在9例血管畸形标本及5例正常血管标本中均未见阳性表达。对VEGF的表达进行卡方检验，结果发现在血管瘤的不同分期中其表达率存在显著性差异（见表1，P<0.05）。  

　　2.2 VEGF在不同年龄组中的表达 在年龄小于等于6岁的患儿中VEGF的表达率为91.43%，而在大于6岁的患儿中则为64.29%。对VEGF的表达进行卡方检验，结果发现在血管瘤不同年龄组中其表达率存在显著性差异（见表2，P<0.05）。

　　表1 VEGF在血管瘤不同时期中的表达　略     　　表2 VEGF在血管瘤中的表达与年龄的关系　略     　　3 讨论     　　Fam等［4］ 认为血管形成包括细胞外基质的蛋白分解，内皮细胞移行和增生，细胞外基质的产生，血管状结构的形成和管道再通。血管瘤是血管生成异常性疾病，血管生成不受控制是其增殖的主要原因［5］ 。VEGF可以对血管生成的各步骤产生影响，从而调节血管的生成。VEGF是一种多肽因子，分子量约48KD，现有6种变异体，分别含有121、145、165、183、189、206个氨基酸残基，具有促进血管内皮细胞分裂、增生、诱导血管形成等作用。VEGF是存在于内皮细胞的特异性生长因子，对内皮细胞有极强的促有丝分裂作用，而对其它细胞无此作用［6，7］ 。在肿瘤、缺血缺氧等情况下，VEGF及其受体呈现高表达，而VEGF不足时会导致血管腔闭合、血管退化［8］ 。    　　我们的研究发现:VEGF在血管瘤增殖期、消退早期、消退晚期的表达阳性率是依次递减的，而在血管畸形标本及正常血管标本中均未见阳性表达。我们在对HE染色的血管瘤及血管畸形标本进行分类时观察到:在增生期的血管瘤标本中可见血管丛的内皮细胞增生活跃，细胞肥大，界限不清，常聚集成团，管腔不规则，甚至闭塞。间质内纤维组织很少并有较多的肥大细胞。而从消退早期到消退晚期，则血管内皮细胞逐渐变扁平，内皮细胞数目逐渐减少，管腔明显可见。同时血管间距逐渐增大，血管间结缔组织逐渐增多，并且出现较多脂肪细胞。在血管畸形的标本中发现血管密集，管腔扩张明显，且其内皮细胞与正常的血管内皮细胞无差别，无异常增生现象。目前认为血管内皮细胞的增殖受多种因素的调节，而VEGF正是其中之一。VEGF的作用机制包括:①是内皮细胞特异性有丝分裂原，在体外可促进内皮细胞生长，体内可诱导血管发生。②可以提高血管通透性。③可以改变胞外基质，使其更有利于血管的生长。④许多生长因子如转移生长因子（TGF）刺激血管新生的作用是通过诱导VEGF的表达而实现的［9，10］ 。我们的实验结果正说明了VEGF在促血管瘤发生中的重要作用。    　　我们的研究也显示:在年龄小于等于6岁的患儿组中VEGF的表达率明显比大于6岁的患儿组高，说明血管瘤易发生于低龄患儿。高瑞琳等［11］ 研究发现，血管瘤发病年龄以2岁以下最多，其次3～6岁，而7～14岁较少，且发生后可自行逐渐消退。这与我们的研究结果一致。史林等［12］ 认为血管瘤易发生于低龄患儿是与其体内的内分泌激素变化有关。具体的机制目前仍不清楚，还有待于我们继续研究。    　　通过本实验的研究，我们认为既然VEGF在血管瘤各分期及血管畸形中表达的差别明显，则可考虑将VEGF作为划分不同时期血管瘤及区别血管瘤与血管畸形的生物学指标之一。同时也可以为研发竞争性抑制VEGF的新药提供理论依据。而且，在临床治疗中也可考虑把VEGF作为检测血管瘤治疗效果的一个有效指标。   

【参考文献】　　［1］ Lieken S，Verbeken E，Vandeputte M，et al.A Novel Ani-mal Model for Hemangiomas:Inhibition of Hemangioma De-velopment by the Angiogenesis Inhibitor TNP-470［J］.Can-cer Res，1999，59（5）:2376-2383.

　　［2］ Mulliken JB，Glowacki J.Hemangiomas and vascular mal-formations in infants and children:a classification based on endothelial characteristics［J］.Plast Reconst Surg，1982，69:412.

　　［3］ 袁新初，周乾毅.转化生长因子β1在毛细血管瘤组织中的表达［J］.武汉大学学报（医学版），2002，23（3）:213-214.

　　［4］ Fam NP，Verma S.Clinical guide to angiogenesis［J］.Cir-culation，2003，108（21）:2613-2618.

　　［5］ Folkman J.Clinical applications of research on angiogenesis ［J］.N Engl J Med，1995，333（26）:1757-1763.

　　［6］ Tokunaga T，Oshika Y，Abe Y，et al.Vascular endothelial growth factor（VEGF）mRNA isoform expression pattern is correlated with liver metastasis and poor prognosis in colon cancer［J］.Br J Cancer，1998，77（6）:998.

　　［7］ Alvarez AMV，Caramelo C，Angeles CM，et al.Role of vascular endothelial growth factor in the response to vessel injury［J］.Kidney Int Suppl，1998，54（68）:7.

　　［8］ 易成刚，郭树忠.血管新生的机制及在整形外科领域中的研究进展［J］.实用美容整形外科杂志，2004，15:315-317.　　　　［9］ Neufield G，Tessler S，Gitay2Gohen H，et al.Vascular endothelial growth factor and its receptors［J］.Prog Growth Factor Res，1994，5（1）:89-97.

　　［10］ Weidner N，Carroll PR，Flax J，et al.Tumor angiogene-sis correlates with metastasis in invasive prostate carcino-ma［J］.AmJ Pathol，1993，143（2）:401-409.

　　［11］ 高瑞琳，林振石，唐秀如.小儿眼部肿瘤205例分析［J］.实用眼科杂志，1993，11（1）:251.

　　［12］ 史林，王玉萍.儿童眼部血管瘤的临床特点［J］.中国斜视与小儿眼科杂志，2003，11（1）:5-6.