血小板膜糖蛋白对动脉粥样硬化内皮细胞基质金属蛋白酶的影响

　　作者：高阳△,陈思娇*,熊盈△,胡怡,魏敏　　作者单位：中国医科大学附属第一医院老年医学研究室，辽宁 沈阳 110001;中国人民解放军第202医院;中国医科大学医学分子生物学研究所。 △中国医科大学硕士研究生

　　【摘要】目的了解血小板膜糖蛋白(GP)Ⅱ b/Ⅲa对基质金属蛋白酶(MMP-2，9)mRNA表达的影响。方法：体外培养人脐静脉内皮细胞，分别用酶谱法和逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)检测MMP-2,-9活性和mRNA表达。待细胞融合成单层后，分别加入无血清培养基，静息期血小板，活化后血小板及白细胞介素-1β(IL-β)， 共同培养60 min后，洗去血小板，内皮细胞继续培养6 h。上清液及细胞分别用于酶谱法检测MMP-2和MMP-9活性，以及RT-PCR分析mRNA表达。结果：内皮细胞与活化血小板共同培养后，酶谱法显示：与对照组相比，未活化的血小板轻微诱导MMP-2和 MMP-9分泌(P<0. 05)，而活化状态的血小板能显著诱导这二者的分泌(P<0. 01)，与IL-1β的作用相当;而且还可以见到62 kDaMMP-2活化形式。加入阻断剂GRGDSP以及GPⅡb/Ⅲa单克隆抗体 (7E3)后检测发现，MMP-2和MMP-9分泌减少。与活化血小板共同培养后的内皮细胞表面表达uPAR和MT1-MMP以及上清液中MMP-2的mRNA与对照组相比明显增高(P<0. 01)，而静息状态的血小板作用不显著。加入GRGDSP或7E3后，mRNA的表达降低。结论：(1)活化状态的血小板与IL-β的作用相当，能显著诱导MMP-2和MMP-9分泌;能明显增高内皮细胞uPAR和MT1-MMP及上清液中MMP-2 mRNA的表达;(2)GPⅡb/Ⅲa阻断剂可能抑制血小板在不稳定斑块部位聚集、粘附等一系列炎症反应。

　　【关键词】 血小板膜糖蛋白,动脉粥样硬化,基质金属蛋白酶

　　Abstract：Objective:To study the effects of GP Ⅱb/Ⅲa on matrix metalloproteinase of blood platelets|endothelial cells mRNA express.Methods:The HUVECs was cultured in vitro.When the cells were sub|confluent, add serum free medium, resting platelets,α-thrombin|stimulated platelets and interleukin-lβ (IL-1β) into the 24 well plate respectively.After 60 min co|incubation under cell culture conditions, all platelets were removed by gentle washing.After an additional 6 hours of incubation of the endothelial cells, supernatant was aspirated and detected the activity of MMP-2 and MMP-9 by SDS-PAGE zymography and detected the mRNA by RT-PCR.HUVEC was analyzed by flow cytometry.Results:HUVEC was incubated with α-thrombin|activated platelets. SDS-PAGE zymography revealed expression of MMP-2 and MMP-9 was only slightly induced by resting platelets(P<0. 05).However, activated platelets significantly induced secretion of the 2 MMPs(P<0. 01) to a comparable extent as achieved by IL-1β.In addition, a second, lower band at 66kDa revealed MMP-2 activation on adhesion of activated platelets.Endothelial expression of MMP-2 and MMP-9 was significantly restrained by GRGDSP and monoclonal antibody of anti-GP Ⅱb/Ⅲa (7E3). HUVEC incubation with activated platelets induced mRNA significantly expression of MMP-2,MT1-MMP and uPAR(P<0. 01) comparable with the control group, but nonstimulated platelets did nothing.Expression of mRNA greatly decreased after administrating GRGDSP or 7E3.Conclusion: Activated platelets significantly induced secretion of the 2 MMPs to a comparable extent as achieved by IL-1β，and can increase mRNA expression of MMP-2, MTl-MMP,and uPAR.GP Ⅱb/Ⅲa blockade may not only inhibit platelet aggregation at the vulnerable plaque,but also may prevent platelet adhesion mediated inflammatory cascades.

　　Key words：Platelet membrane glucoprotein;Atherosclerosis;Matrix metalloproteinase

　　近年来，越多越多的证据表明，基质金属蛋白酶(MMPs)在动脉粥样硬化(AS)发生、发展中起重要作用。AS是一种炎症[1]，炎症应答时多种因子可以上调MMPs的水平，MMPs对AS斑块处的血管重构，斑块的不稳定性及其破裂诱发的血管疾病都起着重要的作用。本研究对此进行初步探索。

　　1 材料与方法

　　1. 1 一般资料

　　成人外周血，健康新生儿脐带，GP Ⅱb/Ⅲa单克隆抗体，GP Ⅱb/Ⅲa与β3整合素 (αvβ3)衔接的阻断剂(GRGDSP)，尿激酶型纤维蛋白酶原激活剂受体(urokinase|type plasminogen activator receptor,uPAR)单克隆抗体，(抗体均购自福州迈新公司)，RT-PCR试剂盒购自Pronega公司，Taq酶为Sangon产品。

　　1. 2 培养人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cell，HUVEC)

　　取新鲜的健康新生儿脐带，PBS冲洗干净，0. 25%胰酶37℃消化5 min，中止消化后收集消化液，1000 r/min 离心6 min。弃上清，加入含20 %小牛血清的RPMI 1640液制成细胞悬液，接种于24孔培养板，隔日换液。经免疫荧光检测第Ⅷ因子相关抗原阳性，鉴定为血管内皮细胞。

　　1. 3 实验分组

　　待HUVEC融合成单层后，取人外周新鲜血洗涤血小板，加水蛭素(hirudin，5U/ml)拮抗血栓素活性后，活化或不经活化制成细胞悬液，加入到24孔板中与内皮细胞共同培养。实验分4组，阴性对照组：加入无血清RPMI 1640培养基;静息期血小板组：加入不经活化的血小板;活化血小板组：加入经α-血栓素活化的血小板;阳性对照组：加入interleukin-1β(IL-β)。60 min后，轻轻洗去血小板，HUVEC继续培养6 h后，吸出上清液，2 000 g/min离心后，与细胞分别于-80℃保存。

　　1. 4 基质金属蛋白酶活性测定

　　实验前24 H，改用无血清培养基培养HUVEC。采用酶谱法[5]，用含明胶的SDS-PAGE检测 MMP-2和MMP-9活性。分离胶浓度为 8%(含1 mg/ml明胶)，浓缩胶浓度为5%。取上清液与上样缓冲液1∶1混合后，取25 μl不经煮沸直接上样，4℃、120V恒压电泳2～2. 5 h，凝胶经2. 5%曲拉通(Triton)X-100漂洗两次后，加反应缓冲液 (50 mmol/LTris-HCl，50 mmol/L NaCl,10 mmol/L CaCl2,1%TritonX-100)，37℃孵育18小时，0. 5%Coomassie 兰 R-250染色，脱色液脱色，MMP-2和MMP-9活性表现为蓝色背景下的透明条带。

　　1. 5 RT-PCR检测蛋白水解酶mRNA的表达

　　用TRIzol试剂 (GIBco.BRL公司)提取各组HUVEC总 RNA，紫外分光光度仪检测RNA的浓度和纯度。1%琼脂糖变性凝胶电泳检测RNA的完整性。48℃ 45 min合成第一条互补DNA(cDNA)链，94℃ 2min失活逆转录酶。随后94℃变性30 s，退火温度具有引物特异性(MMP-2为54℃ 1 min，MT1-MMP为56℃ 1 min，uPAR为63℃ 1 min，β-actin为60℃ 1 min)。引物由上海生工生物工程公司DNA合成仪合成，主要序列如下：MMP-2;5′-CTCGTGCCTTCCAAGTCTGG-3′(上游)，5′-GGCGTTCCCATACTTCACAC-3′ (下游)。转金属硫蛋白基因(MT1)-MMP：5′-CCCTA TGCCTACATCCGTGA-3′(上游)，5′-TCCATCCATCACTTGTTAT-3′ (下游)uPAR：5-ATGGATGCTCCTGTGAAGAG-3′(上游)，5′-CACAGTCTGGCAGTCATTAG-3′(下游)。内参照β-actin 引物序列 为：5-ATCATGTTTGAGA CCTTC AACA-3′(上游)，5-CATCTCTTGGTCGAAGTCCA-3′(下游);GAPDH 引物序列为：5-AATGCATC CTGCACCACCAA-3′(上游)，5-GTAGCCATATTCATTGTCATA-3′(下游)。

　　1. 6 统计学处理

　　数据以均数±标准差(±s)表示，采用方差分析，应用SAS 8. 2版软件处理数据。

　　2 结果

　　2. 1 血小板膜GP Ⅱb/Ⅲa可诱导HUVEC的蛋白水解活性增强

　　HUVEC与血小板共同培养 60 min后洗去血小板，HUVEC继续培养，6 h后提取上清，经酶谱法显示，与对照组相比，未活化的血小板轻微诱导MMP-2和MMP-9的分泌(P<0. 05)，而活化状态的血小板能显著诱导这两种基质金属蛋白酶的分泌(P<0. 01)，而且还可以见到62 kDaMMP-2活化形式，这与IL-1β的作用类似。为了验证血小板膜GP Ⅱb/Ⅲa的作用，选择GP Ⅱb/Ⅲa与β3整合素(αvβ3)衔接的阻断剂GRGDSP以及GP Ⅱb/Ⅲa单克隆抗体(7E3)作用后检测发现，MMP-2和MMP-9分泌减少。

　　2. 2 血小板GP Ⅱb/Ⅲa可促进蛋白水解酶mRNA的表达

　　HUVEC与活化血小板共同培养后，在HUVEC表面表达的uPAR和MT1-MMP以及上清液中MMP-2的mRNA与对照组相比明显增高，分别为对照组的1. 84、2. 51、1. 56倍(P<0. 01)，而静息状态下的血小板对此作用不显著。加入GRGDSP或7E3后，mRNA的表达降低，uPAR、MT1-MMP和MMP-2分别为活化血小板组的86. 1%、74. 8%和81. 4%(P<0 05)。

　　3 讨论

　　基质金属蛋白酶按其结构和底物选择性有：明胶酶(MMP-2/-9)。有研究发现，实验模型动脉球囊损伤后MMP-9表达和激活增强，通过降解血管壁ECM，有利于平滑肌细胞(SMC)突破组织屏障，从中膜向内膜迁移并增殖，使细胞外基质(ECM)分泌增多，形成动脉粥样硬化斑块。而MMP抑制剂减少SMC迁移。粥样病变发展的另一个因素是循环中的炎症因子通过与活化的内皮细胞表达的粘附分子相互作用，为中介的循环炎症细胞的募集提供条件。最近的实验表明，MMP-9可促进这一过程。单核细胞和多聚甲醛固定的人内皮细胞(EC)单层直接相互作用，增加炎症细胞MMP-9分泌。T淋巴细胞和EC单层体外相互作用，使EC表达血管细胞粘附分子1(VCAM1) ，触发T细胞分泌MMP-2。炎症细胞渗出过程中MMP对内皮基底膜的降解作用导致内皮屏障功能降低，血浆蛋白质包括脂蛋白流入增加。一旦进入血管壁，浸润细胞和ECM与氧化脂类相互作用使巨噬细胞MMP产生增多。巨噬细胞也刺激邻近细胞MMP分泌和酶原活化。MMP-9局部增多促进巨噬细胞等炎症细胞的聚集[2]。AS病理生理是动脉粥样斑块破裂或血管受损，内皮下蛋白暴露，与血小板受体结合，导致血小板粘附，在血管受损处产生的ADP、胶原、凝血酶及TXA2等激动剂使血小板激活，进而通过GP Ⅱb/Ⅲa与纤维蛋白原的结合导致血小板的凝聚。血小板与内皮细胞粘附在AS的发生、发展中起重要作用。纤溶酶原系统和MMPs系统的活性异常是导致AS斑块纤维帽稳定性降低的重要因素之一[3～6]。研究表明AS患者血小板膜GPⅡb/Ⅲa的表达明显增高。在AS患者活化的血小板与内皮之间的相互作用能够诱导组织因子、细胞因子及粘附分子的表达，引起血小板对内皮的趋化和粘附增强[7]。这些都可能提示血小板的活化、聚集在AS的发生发展中起着关键的作用[8～10]。

　　血小板膜GP Ⅱb/Ⅲa属于整合素受体大家族的一员，它是一种钙依赖性的二聚体，在细胞粘附和聚集中起着重要作用[11]。与其他多种整合素不同，此受体的组织分布较窄，仅见于血小板和巨核细胞谱系细胞，尤以血小板表面最为丰富。每个血小板表面约有5万～8万个，占血小板总蛋白量的1%～2%。大约70%随机暴露分布于血小板的表面，而其余的位于凹入血小板表面的管道系统和胞浆内的α-颗粒中。

　　本实验发现：(1)与活化的血小板一过性接触可促进HUVEC在mRNA和蛋白水平上表达uPAR，MT1-MMP上调，并能促进HUVEC分泌 MMP-2及MMP-9;(2)β3整合素拮抗剂或GP Ⅱb/Ⅲa单克隆抗体能抑制上述活化过程，另外，加入β3整合素特异性粘抗剂后血小板对HUVEC的作用被明显抑制。因此GP Ⅱb/Ⅲa与β3整合素衔接作用对于促进HUVEC蛋白水解活性是至关重要的。GP Ⅱb/Ⅲa衔接作用启动了一系列继发反应，如作为外部信号的Ca2+增多，近年来，Lindemann等人[15]已发现抑制GP Ⅱb/Ⅲa衔接作用可阻碍IL-1合成。这也进一步证明本实验中发现的血小板粘附与血小板介导的血管壁炎症反应有关。与Lindemann等人的研究结果相似，我们在实验中获得的数据表明GP Ⅱb/Ⅲa衔接可能诱导活化过程的瀑式级联反应，这一过程可能是由炎症血小板复合物如 CD40L，CD62P或IL-1β所启动。

　　总之，本实验提示(1)粘附于血管壁的血小板上某一特定区域在细胞外基质降解过程中发挥重要作用;(2)GP Ⅱb/Ⅲa阻断剂可能抑制血小板在不稳定斑块部位聚集，防止出现管腔狭窄;还可能防止血小板粘附等一系列炎症反应引发的细胞外基质降解和斑块破裂。

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