原发性高血压患者细胞间黏附分子K469E基因多态性与颈动脉内膜中层厚度的相关性研究

　　作者：温培娥,路方红,刘振东,商青,王舒健　　作者单位：山东省医学科学院基础医学研究所，山东省现代医用药物与技术重点实验室，山东省医药卫生肿瘤免疫与中药免疫重点实验室，山东 济南 250062

　　【摘要】目的探讨ICAM1基因K496E多态性与动脉粥样硬化(AS)的关系。方法 对437名原发性高血压(EH)患者进行颈动脉超声检测，根据检测结果将所有患者分为AS组和动脉正常组(正常组)，采用巢式聚合酶链反应和免疫酶联吸附测定技术检测所有患者的细胞间黏附分子1(ICAM1)基因K496E基因型和等位基因分布及ICAM1血浆水平，进行对比分析。结果 AS组KK型频率明显高于正常组(χ2=12.437，P=0.000)，基因型相对风险度分析发现，KK基因型的个体发生AS的危险性是KE或EE型的2.087倍(OR=2.087，95%CI=1.382～3.151);携带K等位基因发生AS的风险是E等位基因的1.962倍。经二元多因素Logistic回归分析，调整年龄、性别、体重指数、收缩压、舒张压、总胆固醇、甘油三酯和高密度脂蛋白等指标后，ICAM1血浆水平、K等位基因和吸烟均不同程度的影响AS的发病，而且K等位基因及吸烟对于AS发病具有一定的协同作用。结论 ICAM1基因K469E多态性与EH患者的AS有相关性，K等位基因可能是AS的遗传危险因素。

　　【关键词】 高血压患者,细胞间,颈动脉,相关性研究

　　【Abstract】Objective To investigate the association between K469E polymorphism of intercellular adhesion molecule (ICAM)1 gene and carotid intimamedia thickness in essential hypertension (EH) patients. Methods 437 EH patients were divided into atherosclerosis (AS) and normal arteries groups. ICAM1 K469E genotype and allele distribution were tested by nested PCR, and serum ICAM1 level was measured by ELISA. Results The frequency of KK genotype in AS group was higher than that in normal group (χ2=12.437，P=0.000). The incidence rate of AS patients with KK genotype was 2.087 times of AS patients with EE or KE genotype(OR=2.087，95%CI=1.382～3.151), and the incidence rate of AS patients with K allele was 1.962 times of AS patients with E allele. Adjusted age, gender, body mass index, blood pressure, total cholesterol, triglyceride and high density lipoproteins, the level of ICAM1, K allele and smoking were influenced factors of the incidence of AS. Conclusions K469E polymorphism of ICAM1 gene is associated with AS, and K allele may be a genetic risk factor of AS.

　　【Key words】 Intercellular adhesion molecule1; Gene polymorphism; Atherosclerosis

　　动脉粥样硬化(AS)是严重危害人类健康的因素之一，其发生和发展与多种因素有关,其中炎性机制在AS斑块的发生、成熟和破裂过程中起着重要的作用。细胞间黏附分子1(ICAM1)是一种炎症细胞因子，因其在炎症早期介导白细胞与受损内皮细胞的紧密黏附而倍受关注。研究证实ICAM1介导的白细胞黏附是心血管AS的发病机制因素之一〔1〕，循环血液中可溶性黏附分子的水平可反映出AS病的炎症状态，并可作为心血管事件的危险预测因子〔2〕。本文采用巢式PCR技术探讨ICAM1基因K496E多态性与AS的关系。

　　1 对象与方法

　　1.1 对象

　　选择2004年6月～2006年9月选取本院附属医院门诊或住院原发性高血压(EH)患者437例,其中男226例，女211例，年龄60～79(平均66.52±5.87)岁。高血压入选标准：依据2003年WHO/ISH高血压诊断标准，即收缩压(SBP)≥140 mmHg (1 mmHg=0.133 kPa)和(或)舒张压(DBP)≥90 mmHg。排除标准：继发性高血压、肥厚性心肌病、冠心病、糖尿病、心脏瓣膜病、结缔组织疾病和其他严重的疾病者及经抗高血压药物规则治疗虽停药但停药不到2月者。所有研究对象均来自汉族人群，无血缘关系。所有患者使用美国ACUSON 128 XP/10型彩色电脑声像仪，探头频率7.0 MHz，患者取仰卧位，逐节段观察双侧颈总动脉、颈内动脉颅外段(ICA)、颈外动脉(ECA)和颈动脉分叉部的横轴实时二维图像，观察管壁内膜情况及有无斑块形成。颈总、颈内动脉的内膜中层厚度(IMT)<1.0 mm，其内膜可以不光滑，但无明显隆起斑块形成者为颈动脉正常;发现斑块和(或)颈总、颈内动脉的IMT≥1.0 mm为颈AS。

　　1.2 血样采集和DNA提取

　　用含有EDTA抗凝剂的真空管抽取研究对象肘部空腹静脉血2 ml，采用标准酚氯仿法提取基因组DNA。PCR扩增及基因型分析采用巢式聚合酶链反应(巢式PCR)方法鉴定ICAM1基因的基因型。

　　1.3 PCR引物

　　序列为S1：5′CCCCGACTGGACGAGAGG3′，S2：5′GGGGCTGTGGGGAGGATA3′;St:5′CACATTCACGGTCACCTT3′,Sc:5′CACATTCACGGTCACCTC3′〔3〕。引物St / Sc根据研究位点突变的等位基因设计。首次PCR反应产物长度为331 bp 。总反应体系为25 μl:25 ng DNA模板，dNTP各0.2 mmol/ L，2.0 U Taq DNA聚合酶,上下游引物(S1、S2)各15 pmol/L;95℃预变性10 min;按以下程序循环36次，即：95℃变性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，末次循环后，72℃再延伸7 min。将首次PCR产物按1∶50 稀释，加入特异性引物(St/Sc) 进行二次扩增,确定ICAM1等位基因，产物长度237 bp。95℃预变性10 min;依次按95℃变性30 s，56℃退火5 s，72℃延伸30 s 循环15次;72℃再延伸7 min。二次扩增产物经2%琼脂糖凝胶电泳，溴化乙啶染色，紫外灯下观察结果，确定基因型。

　　1.4 ICAM1血浆水平测定

　　采用免疫酶联吸附实验，试剂盒由法国Diaelone公司提供，操作严格按说明进行。

　　1.5 统计学处理

　　基因型和等位基因频率采用直接计数法,χ2检验比较基因型和等位基因频率,并做二元多因素Logistic回归分析冠心病的危险因素。数据均采用SPSS 10.0 统计软件进行分析。

　　2 结果

　　2.1 根据颈动脉超声结果进行分组

　　AS组及动脉正常组(正常组)。2组患者颈动脉IMT及一般临床资料包括SBP、DBP、体重指数(BMI)、总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白胆固醇(HDLC)、ICAM1、颈动脉IMT的分析。从表1结果表明，AS组血浆ICAM1水平，颈动脉IMT显著高于正常组(P<0.001)，AS组吸烟明显高于不吸烟(P=0.033);其余各项无显著差异(P>0.05)。

　　2.2 基因型分析

　　首次PCR 反应产物电泳后，紫外灯下显示331 bp电泳带;经等位基因特异性引物扩增后，紫外灯下确定基因KK型(仅引物St引出237 bp带)、KE 型(引物St、Sc均引出237 bp带)、EE型(仅引物Sc引出237 bp带)。

　　2.3 基因型与等位基因频率

　　两组基因型分布均符合HardyWeinberg平衡(P>0.05)。两组基因型和等位基因频率差异显著(P<0.05)。AS组KK型频率明显高于动脉正常组(χ2=12.437，P=0.000)，基因型相对风险度分析显示，KK基因型的个体发生AS的危险性是KE或EE型的2.087倍(OR=2.087，95%CI=1.382～3.151);携带K等位基因发生AS的风险是E等位基因的1.962倍。

　　2.4 K等位基因与ICAM1水平的关系

　　含K等位基因(KK+KE基因型)个体的ICAM1血浆水平为(348.43±116.71)μg/L，高于不含K等位基因(EE基因型)个体(295.39±102.94)μg/L，比较差异显著(F=7.538，P=0.000)。表2 ICAM K469E多态性及相对风险分析(略)

　　2.5 危险因素回归分析

　　以是否发生AS为因变量，做二元多因素Logistic回归分析，调整年龄、性别、BMI、SBP、DBP、TC、TG和HDLC等指标后，ICAM1血浆水平、K等位基因和吸烟均不同程度的影响AS的发病，OR值分别为1.007、1.962、1.830，P值分别为0.000、0.000、0.029。而且K等位基因及吸烟对于AS发病具有一定的协同作用，OR值为2.237，P值分别为0.002，95%CI为1.356～3.882。

　　3 讨论

　　ICAM1属黏附分子免疫球蛋白超家族成员之一，是由507个氨基酸组成的单链跨膜糖蛋白，表达于内皮细胞及多种白细胞表面，它是体内的一种促炎细胞因子，参与多种白细胞的黏附与聚集;同时还可参与脂类代谢，影响TC、LDLC和HDLC等的水平。它们在炎症反应、AS及血栓形成中起着重要作用〔4〕。研究证实ICAM1基因位于第19号染色体短臂上，为一段长15.5 kb的DNA序列，含7个外显子和6个内含子。ICAM1 基因第6 外显子存在腺嘌呤(A)到鸟腺嘌呤(G)的改变，导致编码的第469位氨基酸赖氨酸(K)到谷氨酸(E)的改变。这种基因变异可影响ICAM1 的转录和表达，进而影响ICAM1相关疾病的发生、发展和转归。

　　AS的发生和发展与多种因素有关，其中炎性机制在动脉粥样硬化斑块的发生、成熟和破裂过程中起着重要的作用。有研究证实ICAM1介导的白细胞黏附是心血管AS的发病机制因素之一〔1〕，ICAM1基因多态性与冠状AS性心脏病及缺血性心肌梗死易感性相关〔3〕，含等位基因K(基因型为KK和KE)的个体，患冠状AS性心脏病和缺血性心肌梗死的危险度明显升高,其发病率是EE基因型的3.32倍。本研究证实AS组K等位基因频率(60.6%)高于动脉正常对照组(44.0%)，携带K等位基因发生AS的风险是E等位基因的1.962倍;(KK+KE)基因型个体的ICAM1水平高于EE型个体;调整混杂因素后，Logistic回归显示ICAM1血浆水平、K等位基因和吸烟均不同程度的影响AS的发病，其中KK基因型患AS的危险性是KE+EE型的2.087倍，提示ICAM1基因K469E多态性对其分子血浆水平有一定的影响，其中K等到位基因有可能是AS发病的危险因素之一。

　　研究表明，可溶性黏附分子的水平是AS程度的生物标志物。血浆中ICAM1的水平与颈动脉IMT有关，它是早期AS的标志，也是其存在和发展的较好观察指标。Wojakowski等〔5〕研究来自AS高危险性家庭但脂蛋白水平正常的儿童，发现其血浆中ICAM1的水平较对照组明显升高。ICAM1基因多态性对其分子血浆水平的影响存在一定的理论基础。文献〔6〕通过对776名健康人(包括儿童和青少年)ICAM1基因G241R多态性的检测表明，R等位基因与ICAM1表达低水平明显相关;而有关ICAM1基因K469E多态性与其分子血浆水平的研究，国内外报道较少〔7〕。本研究中显示含K等位基因(KK+KE基因型)的个体ICAM1血浆水平明显高于EE基因型的个体(P=0.000)，提示K等位基因的存在有可能影响ICAM1的表达。

　　本研究回归分析显示，ICAM1基因469K/E 多态性与吸烟有明显的协同作用。该作用机制是由于吸烟影响了ICAM1的表达。ICAM1基因的5调节区域有NFκB结合位点。NFκB是一种DNA结合蛋白，是多种促炎症基因高度转录的必须因子，参与细胞对一系列生理性、病理性刺激(如氧中毒、活性氧、缺血/再灌注等)做出的快速反应，通过与数种基因启动子、内含子中的特定DNA序列结合而发挥转录因子的作用。香烟中含有高浓度的活性氧，可以通过活化的NFκB增强ICAM1基因转录来刺激其分子表达。因此，ICAM1基因469K/E多态性与吸烟的协同作用存在一定的分子生物学基础。

　　本研究结果显示，K等位基因的存在增加了AS发生的危险性，而且与吸烟影响AS发生的危险性有协同作用;ICAM1基因469K/E多态性可能与AS的发生、发展及该疾病的严重程度密切相关，因此通过检测基因型筛查AS患者中的高危人群，对及早发现和及时预防具有重要意义。

　　【参考文献】

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　　7 汪明,李艳，张平安，等.心肌