脆性X综合征实验室诊断研究进展

作者：富显果    作者单位：福建医科大学 福总临床医学院、南京军区福州总医院，福州 350025

【关键词】  脆性X综合征 突变 甲基化聚合酶链反应 免疫组织化学

　　Advances in the laboratory diagnosis of fragile X syndrome

　　FU Xianguo, ZHANG Duo, LAN Fenghua

    脆性X综合征(fragile X syndrome,FXS)是一种常见的遗传性智力低下综合征。其全突变（full mutation，FM）相关表型发病率在男性约为1/4 000，女性约为1/6 000[1]。该病发病具有明显的性别差异，男性FXS病人主要的临床特征为：轻到重度的智力低下、巨睾、特殊面容（长脸、大耳、尖下巴等）。部分男性病人也表现为多动、注意力不集中、目光接触回避、拍手等行为障碍；全突变女性患者大约60%表现为轻到中度的智力低下，其余40%正常[23]。

　　1  疾病基因与发病机理

    1991年，Verkerk等应用定位克隆法在Xq27.3处克隆了脆性X智力低下基因（fragile X mental retardation gene 1,FMR1）[4]。正常FMR1基因位于染色体Xq27.3,长38 Kb,由17个外显子和16个内含子组成。FMR1基因是一个高度保守的基因，cDNA全长为4 661 bp，在5’端非翻译区有一个(CGG)n的重复序列,其上游250 bp 处有一个CpG岛。（CGG）n重复序列长度具有多态性，并依据其等位基因重复数分为四种类型：正常、中间型（灰区）、前突变（premutation，PM）、全突变（表1）。当n＜50时，FMR1基因表达正常；当n介于50～58时，FMR1基因处于稳定正常表达的等位基因与不稳定的前突变等位基因的重叠区，在该范围内FMR1基因一般传递稳定，但随着n的增大在传递过程中发生不稳定扩展的可能性不断增大；当n介于59～200时，携带者表型正常，但女性携带者在传递过程中,易将突变的基因传递给子代,并发生进一步扩展，称为FMR1基因前突变；当n＞200时，男性100%表现出典型的FXS症状，女性依据X染色体失活的不同而表现出不同程度的临床症状，称为FMR1基因的全突变[3，5]。约95%以上的FXS患者是由上述全突变基因型造成的，在这些患者中FMR1基因 5’侧CpG岛异常甲基化，使FMR1基因表达失活，导致FMRP的缺失引起智力低下，同时还有5%以下的FXS患者则是由FMR1基因的错义突变和缺失型突变，影响了FMRP的正常结构和功能，而导致FXS。

　　2  实验室诊断方法

    FXS临床表现各异、复杂多样，单从临床特征方面无法进行早期诊断。因此遗传学方法成为诊断的主要依据。早期遗传学方法通过分析FXS的细胞遗传学标志染色体Xq27.3存在对叶酸敏感的脆性位点来诊断该病，但该方法费时、繁琐、产前诊断的可靠性差 。目前，根据FMR1基因突变的独特性,已建立了多种有效的实验室诊断方法。表1  脆性X智力低下基因突变类型（略）

　　2.1  Southern杂交

　　FXS患者FMR1基因5’端非编码区（CGG）n三核苷酸串联重复序列异常扩增，其上游约250 bp处CpG岛（调控序列）异常甲基化，使其甲基化敏感性酶切位点消失，应用限制性内切酶进行酶切并用探针标记，分析其片断大小来诊断FXS。1991年，Rousseau等从外周血提取基因组DNA，应用EcoR I和Eag I双酶切DNA，并用非同位素标记的探针StB12.3与其杂交，分析杂交后的DNA片断大小，了解CGG的重复数和CpG岛甲基化程度，成功地区分了正常基因型、前突变和全突变[6]。Southern杂交法结果准确、可靠、敏感性和特异性高，被作为其它检测方法的参照[718]。但是Southern杂交技术繁琐、费时、需要相对大量的基因组DNA，因而不适于常规筛查。

　　2.2  常规PCR

　　1991年，Fu等应用PCR扩增包括(CGG)n重复区域在内的DNA片断，产物经凝胶电泳分析，检测基因组DNA脆性X突变位点的CGG重复情况，研究脆性X突变位点的长度多态性，诊断FXS[7]。PCR方法只能检测正常和小片段前突变等位基因，但对于大片段前突变和全突变，由于GC含量增高和CGG的重复数增多，导致极高的Tm值和CGG重复之间形成二级结构，而不能可靠的鉴别，同时也不适于男性嵌合体患者（全突变伴有前突变等位基因）和女性患者（X染色体失活）的诊断。有报道称，应用7deazadGTP替代dGTP，并且在反应体系中添加5%的聚乙二醇，有助于优化PCR扩增条件[89]。PCR方法以其简单、灵敏、快捷的特点，适用于FXS的筛查。

　2.3  甲基化特异性PCR（MSPCR）

　　根据亚硫酸盐对甲基化和非甲基化DNA不同修饰作用—未甲基化的胞嘧啶可以被亚硫酸盐脱氨转化为尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶则保持不变，进行特异的PCR扩增，据此可区分出甲基化和非甲基化的序列。1994年，Clark等应用亚硫酸钠将单链DNA上胞嘧啶残基转化为尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶则保持不变，随后采用特异性引物扩增并测序来检测目的DNA片断上的甲基化胞嘧啶[10]。根据这种方法建立了多种相关的甲基化特异性检测方法来诊断FXS。   　　2001年，Weinhausel和Hass建立了一种甲基化特异性二联PCR反应来检测FXS。该方法结合了FMR1基因CGG长度多态性、CGG重复的甲基化分析和FMR1基因与X染色体失活特异性转录本(X inactivation specific transcript，XIST)基因启动子的甲基化分析（XIST基因启动子甲基化状态与FMR1基因相反，作为内对照和半定量分析的标准），目的DNA经亚硫酸钠处理后，通过设计两套不同的引物对（1对甲基化特异性引物和1对非甲基化特异性引物）扩增FMR1基因(CGG)n重复序列、FMR1和XIST基因的启动子，然后以XIST基因为标准，应用FMR1基因甲基化比例测定来检测FMR1基因的甲基化状态。该方法可以检测包括正常人、携带者、男性与女性患者在内的11种等位基因型，但重复数较大的前突变等位基因可能会被漏检[11]。2006年，杨芳等利用该方法对40份智障患儿标本和20份正常对照标本进行检测，结果表明其甲基化与非甲基化状态，与标本的性别一致，但也提出存在亚硫酸盐修饰不完全的问题[12]。Zhou等依据亚硫酸盐对甲基化和非甲基化DNA的不同修饰作用，建立了一种甲基化敏感性3联PCR反应[13]：一个特异性PCR（nonMet PCR）检测所有非甲基化等位基因（正常和前突变）；另2个PCR(MetPCR和mTPPCR)用于区分甲基化等位基因（正常、前突变和全突变）。与Weinhausel等建立的以启动子区PCR片段甲基化与非甲基化的比值分析来检测突变等位基因不同的是，该方法采用3对引物PCR（TPPCR）来检测甲基化等位基因，可以特异性的检测所有的前突变和全突变等位基因。同时Zhou等也提出，当CGG重复数n＞350时，该方法敏感性较差。据报道，应用该方法已成功鉴别了44个男性和45个女性的基因型。2006年，Zhou等应用荧光特异性标记引物进行甲基化敏感性三联PCR反应，PCR扩增产物采用毛细管电泳分析。该方法克服了琼脂糖凝胶电泳无法精确检测CGG重复数的缺点[14]。

　　2.4  甲基化特异性熔点曲线分析

　　CpG岛异常甲基化导致FMR1基因失活，引起FMRP缺失。通过CpG岛甲基化状态的检测有助于FXS的诊断。利用亚硫酸盐对甲基化和非甲基化DNA不同修饰作用，经亚硫酸盐处理过的甲基化与非甲基化DNA片断，因其PCR扩增片段（dsDNA）GC含量不同，具有不同的Tm值,在熔点曲线分析中显示不同熔点峰，可进行区分。2001年，Worm等建立荧光熔点曲线分析方法检测DNA CpG岛甲基化状态[15]。其基本步骤是：亚硫酸钠处理基因组DNA；在DNA结合染料SYBR GREEN I存在下，扩增处理后的基因启动子区CpG岛；缓慢升温并实时收集荧光信号来检测PCR产物的熔点特性。从熔点峰结果可以区分4种不同的甲基化状态：非甲基化等位基因产生一个低熔点峰；甲基化等位基因产生一个高熔点峰；同时具有非甲基化和甲基化等位基因，则产生一高一低2个熔点峰；甲基化嵌合体在高低两峰之间产生一个宽熔点峰。2007年，Dahl等通过设计扩增包含8个CpG位点的引物，应用Worm等建立的方法来诊断FXS。Dahl等报道该方法可快速地、可靠地检测男性FXS患者；但女性患者与女性健康者，由于X染色体失活机制(Lyon化)，两者甲基化状态一样，无法进行区分[16]。

　　2.5  RTPCR

　　FXS患者中约有5%是由于FMR1基因缺失或点突变，影响FMRP的正常结构引起。这些病例通过检测（CGG）n重复数和CpG岛甲基化状态无法确诊，因此从mRNA水平检测FMR1基因的缺失或点突变，有助于这部分患者的诊断。Pai等应用RTPCR从干燥的血液标本中提取RNA检测FMR1基因表达缺失，该方法适用于检测大部分的男性FXS患者[17]。

2.6  免疫细胞化学诊断方法

　　FMR1基因突变均会导致不同程度的FMRP缺失或功能异常。因此，可以通过免疫细胞化学检测FMRP的表达情况来诊断FXS。Willemsen等报道，用抗体检测外周血FMRP进行FXS快速诊断的方法。该方法主要步骤为：取外周血血涂片经固定、破膜、内源性碱性磷酸酶封闭；加入鼠抗FMRP单克隆抗体与FMRP结合；加入生物素偶联的羊抗鼠IgG；再用生物素链亲和素碱性磷酸酶复合物显色，显微镜下观察阳性细胞，对FMRP表达情况进行分析。利用此法，所有正常对照均有FMRP表达，而男性FXS患者均为阴性；女性的一条染色体失活（Lyon化），具有全突变的女性患者（尤其成年女性）其淋巴细胞的正常染色体有优先表达的倾向，大多数的淋巴细胞FMRP呈阳性，有高度假阳性的危险[18]。该方法简便快速、费用低、一天内可以完成诊断，不仅可诊断由（CGG）n扩增导致的FXS患者，还可以检出由于缺失、点突变导致的FMRP缺如的患者，适用于群体筛查。但该方法仅适于男性FXS患者的检测，而不适于前突变的携带者的检测（前突变的等位基因，其FMRP是正常表达的），并且在诊断女性患者时有很大的局限性。    　　Willemsen等通过抗体检测发根毛囊中FMRP表达水平来诊断FXS。所有正常对照发根中均有FMRP表达；在男性全突变患者发根中无FMRP表达或仅有微量表达；男性嵌合体及女性全突变患者中FMRP表达下降；男性嵌合体患者与正常对照无交叉现象，男性FXS患者FMRP表达水平最高达33%，而正常对照FMRP表达水平最低达77%[19]。该方法能够可靠地检测男性FXS患者，与外周血FMRP水平检测相比更具有无创性的特点；且头发与神经组织均来源于外胚层，而外周血淋巴细胞来源于中胚层，发根中的FMRP表达水平与智力低下更有相关性，更具有诊断价值，认为发根中FMRP水平检测可以作为女性全突变携带者认知功能的诊断指标[2]。

　　3  问题与展望

    FXS目前并无有效的治疗方法，且FMR1基因（CGG）n重复序列存在传递扩展的特性，因此对于FXS的筛查和诊断尤为重要。已建立的多种FXS的筛查和诊断方法各有优缺点，依靠单一方法，尚无法准确诊断该病。根据不同方法的特点进行联合检测，有助于FXS筛查和诊断，例如邬玲仟等应用PCR与RTPCR相结合的方法,成功地对6个智力低下家系进行诊断[20]。FXS的实验室诊断还有很大的研发空间。

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