福州地区儿童急性呼吸道感染与人类冠状病毒NL63

作者：曾秀雅， 伍严安， 吴小青， 陈发林， 陈发文， 赵 采， 马晓宁   

作者单位：福建医科大学 省立临床医学院、福建省立医院 检验科，福州 350001

【摘要】  目的 探讨福州地区小儿急性呼吸道感染是否与人类冠状病毒NL63（HCoV-NL63）相关。 方法 收集211份急性呼吸道感染（ARTI）患儿鼻咽分泌物，RT-PCR法对HCoV-NL63 1b基因进行筛查，阳性者再对HCoV-NL63 1a基因进行扩增并与GenBank中相关序列进行比较。 结果 HCoV-NL63 1b基因阳性标本3份（1.4%），用HCoV-NL63 1a基因扩增也得到阳性结果，PCR产物测序后与基因库中多株HCoV-NL63 Ⅰa基因比较，同源性98%～99%。 结论 福州地区部分儿童急性呼吸道感染与HCoV-NL63有关。

【关键词】  呼吸道感染； 急性病； 冠状病毒属； HCoV-NL63； 福建

    Acute Respiratory Tract Infection Associated

    with Human Coronavirus-NL63 in Children in Fuzhou

    ZENG Xiuya, WU Yan’an, WU Xiaoqing, CHEN Falin, CHEN Fawen,  ZHAO Cai, MA Xiaoning

    Department of Medical Laboratory, Fujian Provincial Hospital,

    Provincial Clinical College, Fujian Medical University, Fuzhou 350001, China

    ABSTRACT:  Objective  To investigate whether the novel human coronavirus——NL63(HCoV-NL63) was related to acute respiratory tract infections(ARTI) in children in Fuzhou area of China.  Methods  Nasopharyngeal secretion samples were collected from 211 children with ARTI, and screened for HCoV-NL63 by RT-PCR amplified fragments representing the 1b and 1a genes.  The positive amplicons were sequenced and analyzed.  Results  Three(1.4％) out of the 211 samples were positive for 1 b gene of HCoV-NL63, and also showed positive results on 1a gene.  The nucleotide sequencing showed that the PCR products were 98％～99％ identilied to that of 1a gene fragments of HCoV-NL63 from GenBank.  Conclusion  It is suggested that only some of acute respiratory tract infections in young children in Fuzhou area are related to HCoV-NL63．

    KEY WORDS:  respiratory tract infections acute； disease coronavirus; HCoV-NL63； Fujian

    呼吸道病毒感染病原学十分复杂，目前报道在儿童急性呼吸道感染（acute respiratory tract infections，ARTI）疾病中，病毒感染主要病原为呼吸道合胞病毒(RSV)、人偏肺病毒(HMPV)、冠状病毒、流感病毒、腺病毒及鼻病毒。还有一部分儿童的ARTI，虽然认为是由病毒感染引起，但是其病原并未被阐明［1］。2004年，两个荷兰研究小组分别在ARTI患儿的呼吸道标本中分离到一种新的冠状病毒——HCoV-NL63，该病毒可在婴幼儿和免疫抑制患者中引起急性上呼吸道和下呼吸道感染［2-3］。为探讨HCoV-NL63对儿童ARTI的影响，笔者对福州地区ARTI儿童中HCoV-NL63 感染情况进行调查,报道如下。

    1  对象与方法

    1.1  对象  收集在2006 年11月-2007年5月福州地区因ARTI就诊的患儿咽拭子、鼻咽抽吸物或者痰标本共211 份。男性138 例，女性73 例，年龄15 d～12岁；门诊患儿139例，住院患儿72 例。门诊患儿咽拭子采集时间在发病<2 d，未使用任何抗病毒药物之前；住院患儿于入院第2天采集咽拭子或鼻咽抽吸物及痰标本。急性呼吸道感染的临床诊断标准参照文献［4］。

 1.2  主要试剂及材料  病毒核酸提取试剂盒［法国生物梅里埃公司（Biomerieux）］，逆转录试剂盒(美国Fermentas公司)，Ex Taq DNA聚合酶、dNTP(日本 TaKaRa 公司)，PCR扩增仪（7300，美国ABI公司）。HCoV-NL631a和HCoV-NL631b基因的引物分别根据文献［2］和［5］由大连宝生物(TaKaRa) 公司合成（表1）。

    1.3  方法

    1.3.1  病毒核酸提取及逆转录  将采集的咽拭子表1  HCoV-NL631a 、HCoV-NL631b基因RT-PCR引物寡核苷酸序列洗涤入装有无菌生理盐水大约0.5 mL的EP管中；鼻咽抽吸物及痰标本加入含有病毒保护液约1 mL的Ep管中, 置漩涡振荡器上充分振荡混匀，反复冻溶2次后离心吸上清液用于病毒核酸提取。按照病毒核酸提取试剂盒及逆转录试剂盒的详细说明书操作。用随机引物逆转录合成cDNA。

    1.3.2  聚合酶链反应  （1）PCR扩增HCoV-NL631b基因。PCR反应体系为25 μL，反应条件：95 ℃ 5 min→95 ℃ 30s→56 ℃ 40 s→72 ℃ 40 s，扩增40 个循环；72 ℃延伸10 min。扩增产物237 bp。（2）PCR扩增HCoV-NL631a基因。经过HCoV-NL63 1b基因检测为阳性的标本，用HCoV-NL63 1a基因引物扩增位于1a基因的长片段，PCR反应条件：95 ℃ 5 min→95 ℃ 30s→54 ℃ 50 s→72 ℃ 50 s，扩增50 个循环；72 ℃延伸10 min。扩增产物为526 bp。

    扩增产物以含0.5 μg/mL溴化乙啶的1.5％琼脂糖凝胶电泳进行检测。HCoV-NL63 1b、HCoV-NL63 1a阳性PCR产物均送上海英骏公司进行DNA测序。测序结果与GenBank中HCoV-NL 63基因序列进行比较,用DNA MAN软件做基因进化树分析。

    2  结  果

    2.1  HCoV-NL63感染患儿临床资料  HCoV-NL63检测阳性3例患儿，门诊2例，住院1例；男性2例，女性1例；年龄分别为3,5岁和3个月。临床诊断分别为毛细支气管炎、支气管炎、支气管肺炎伴心力衰竭。

    2.2  PCR扩增  211份标本经RT-PCR法用HCoV-NL63 lb基因引物检测到3份阳性标本，阳性率1.4％。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳检测，表现为单一特异条带，相对分子质量约为237 bp,与预期结果相符（图1）。3份经HCoV-NL63 1b基因检测阳性的标本用HCoV-NL63 1a基因的引物进行PCR扩增，得到目的片段约526 bp，与预期结果相符（图2）。

    1～3：HCoV-NL63 1b基因阳性PCR产物；4：100 bp DNA ladder.

    图1  HCoV-NL63 1b基因扩增产物电泳图

    Fig 1  Electrophoretogram for the PCR products of HCoV-NL63 1b gene

    2.3  PCR扩增产物序列测定与分析

    2.3.1  HcoV-NL63 lb基因扩增产物核苷酸序列测定  将3份HCoV-NL631b基因阳性扩增产物进行核苷酸序列测定，3份标本PCR扩增片段核苷酸同源性为100%，测序结果完全相同。将测序结果在NCBI中进行Blast比对，所测序列证实为HCoV-NL63部分1b基因(图3)。

    1：100 bp DNA ladder；2～4：HCoV-NL63 1a基因阳性PCR产物.

    图2  HCoV-NL63 1a基因基因扩增产物电泳图

    Fig 2  Electrophoretogram for the PCR products of HCoV-NL63 1a gene

    图3  HCoV-NL63 lb基因PCR扩增片段测序

    Fig 3  Sequencing result of PCR fragment from lb gene of HCoV-NL63

    2.3.2  HCoV-NL63 la基因扩增产物核苷酸序列测定与同源性比较及进化树分析  3份1b基因检测阳性的标本用 1a基因的引物进行PCR扩增，扩增产物进行核苷酸序列测定，3份扩增产物的核苷酸同源性为100%；将其命名为FZ07416 (图4)，并在GenBank中进行比较。结果显示：该扩增片段FZ07416与荷兰的2个原型株（NC 005831、 AY518894）核苷酸同源性分别为99.4%和98.9%；与荷兰（AY567494）、加拿大（AY675541）、澳大利亚（AY746453）及北京的（DQ353700）和（DQ353701）核苷酸同源性分别为98.1%、99.5%、99.3%、98.5%、98.5%；与HCoV-229E（NC 002645）的同源性为63%，与HCoV-OC43(NC 005147)的同源性仅为41%。

 图4  HCoV-NL63 FZ07416株la基因PCR扩增片段测序结果

    Fig 4  Sequencing result of PCR fragment from la gene of HCoV-NL63 FZ07416    FZ07416株la基因扩增片段DNA测序结果与GenBank中其他地区HCoV-NL63及HCoV-229E、HCoV-OC43基于部分1 a基因核苷酸序列的种系进化树分析也显示，HCoV-OC43自成一簇，HCoV-229E与HCoV-NL63分属不同亚簇，福州地区的HCoV-NL63与荷兰的1株原型株(NC-005831)、加拿大(AY675541)及澳大利亚（AY746453）的亲缘性最近（图5）。

    NC-002645:HCoV-229E；AY567494：荷兰；FZ07416:福州；AY675541：加拿大；NC-005831，AY518894：荷兰的两个原型株；DQ353700，DQ353701：北京；AY746453：澳大利亚； NC 005147：HCoV-OC43.

    图5  HCoV-NL631a基因部分DNA序列系统进化树分析

    Fig 5  Phylogenetic tree analysis of HCoV-NL63 based on a part of sequence of la gene

    3  讨  论

    冠状病毒属为有膜单股正链RNA病毒，属有壳病毒目、冠状病毒科。目前，根据血清型冠状病毒主要分为3个群。最初所知能感染人类的HCoV-229E和HCoV-OC43分别属于第1群和第2群，SARS相关冠状病毒(SARS-CoV)被归类于新的一群［6-7］。由于SARS的原因，冠状病毒对人类疾病的作用越来越受到重视。

    学者们通过对HCoV-NL63全基因组的分析显示，除了M基因外，HCoV-NL63与HCoV-229E的一致性最高，因此把HCoV-NL63归为Ⅰ群冠状病毒，分别属于不同亚群［2］。随后HCoV-NL63得到了广泛的研究，其在人群中的感染阳性率分别在1.2%～9.3%［5，8-14］。我国大陆先前只有北京地区在2006年报道245份急性呼吸道感染儿童的标本中检出3份HCoV-NL63阳性（阳性率1.2%）［15］。HCoV-NL63可感染不同年龄范围的儿童及成年人，但主要集中在0～5岁的婴幼儿中。临床诊断以肺炎和毛细支气管炎居多［5,8-14］。本研究结果基本与报道相似，但有1例3个月龄的患儿合并心力衰竭，提示HCoV-NL63病毒感染对低龄患儿可以引起严重并发症，值得注意。此外，HCOV-NL63常发现与RSV、副流感病毒、流感病毒、人类偏肺病毒等发生合并感染［5,10，12］。本研究中检测到的3份阳性标本中同时检测了RSV与HMPV，未发现与这些病毒合并感染。

    本检测HCoV-NL63阳性标本的阳性率为1.4%,与文献［15］接近。根据HCoV-NL631a基因526 bp序列片段与GenBank中其他地区的HCoV-NL63的进化树分析,显示福州地区的HCoV-NL63与荷兰的1株原型株(NC-005831)、加拿大(AY675541)及澳大利亚（AY746453）的亲缘性最近，提示我国东南沿海地区同样有HCoV-NL63感染。本研究小组曾报道在福州地区急性呼吸道感染患儿中检测到HMPV［16］。建议对ARTI患者进行这些病毒的检测，以便明确病因，针对性地抗病毒治疗，避免临床不合理使用抗生素；对ARTI的流行病学调查也有十分重要的意义。

    (致谢：感谢荷兰阿姆斯特丹大学Vander Hoek教授赠送阳性对照标本。）

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