靶向程序性死亡因子-1配体的RNA干扰慢病毒载体构建及人胰腺癌稳转细胞株的建立
发表时间：2014-12-17 浏览次数：1178次
程序性死亡因子一1配体(PD-Ll)是T细胞共刺激分子B-7家族成员,胰腺癌PD-I_1表达水平与不良预后有关’本研究旨在构建PD-Ll的RN:A干扰重组慢病毒,并建立稳定低表达PD-I,1的胰腺癌Patu8988细胞株. 一、材料与方法 1.根据PD-Ll(NM_014143)序歹,},合成4条针对PD-I,1基因的*hRN:}序列,单链DNA的正义链按Sp向3p顺序依次为:酶切位点AgeI)、干扰序列(21bp)}Loop环(CTCGAG)、干扰序列的反向互补序列(21by)、终止信号(TTTTT),酶切位点(EcoRI)将shRNA插人到质粒GV115中,构建4个相应的重组RNA干扰质粒.构建过表达PD-Ll的质粒pEGFP-N1-3FLAG-PD-L1. 2.质粒转染293T细胞,实验分为6组,A组为空细胞组.B一F组每孔加过表达质粒.B组再转染阴性对照质粒,C,D,E,F组分别再转染4个重组RNA干扰质粒Westernblot检测FLAG蛋白表达将携带干扰效果最佳序列的慢病毒重组质粒载体pGC-T.\--PR-I,l-:hRNA与病毒包装辅助载沐pHelper1.0及pHelper2..ff:转染到?93T细饱y,获重组慢病毒PD-L1-R\Ai. 3.Patu8988细胞感染重组慢病毒FD-Ll-RNAi,流式细胞仪分选阳转细胞,建立稳定低表达PD-Ll的Patu8988细胞株实时定量逆转录一聚合酶链反应(R'1'-qPCR)检测PD-LlmRW1水平,}Cexternblot检测PD-L1蛋F}表达. 二、结果 4个靶向PD-L1的重组RNA十扰质粒及过表达PD-L1的质粒载体构建成功因293T细胞不表达FLAG标签,而过表达质粒是将PD-L1与FLAG融合表达,只要FLAG蛋白有敲减,就可推断PD-Ll被敲减,从而筛选有效靶点进行病毒包装3号靶点(序列为5'-GAC-CTATAT(1'GGTAGAGT.4T-3')敲减作用最强,以3号序列的shRNA进行慢病毒包装.RT-qPCR显示,低表达细胞株PD-LImRNA与Patu8988组比较抑制率达79.5%}}KTesternblot检测显示,低表达细胞株PD-Ll蛋白表达与Patu8988组比较抑制率达64.1%稳定低表达PD-LI的Patu8988细胞株建立成功. 三、讨论 T细胞活化除需要T细胞受体传导的第一信号外,还需要协同刺激分子传导的第二信号,PD-LI为负性协同刺激分子中的成员,是患者预后不良的独立因素研究结果显示,PD-Ll在胰腺癌细胞的表达亦明显高于正常细胞2一3PD-Ll使肿瘤细胞逃避了细胞毒性T淋巴细胞的免疫攻击、抑制树突状细胞的功能及诱导免疫抑制性细胞因子表达"近年发展起来的RNAi技术,具有高效性且特异性强等优势.而慢病毒载体转染效率高,且能将目的基因整合到宿主细胞染色体中,并在子代中稳定表达5本研究经}}esternblot检测标记蛋白FLAG间接检测RNA十扰效率,筛选出最有效干扰序列,进而构建重组RVA干扰慢病毒载体感染胰腺癌Patu8988细胞,建立了稳定低表达PD-L1的Patu8988细胞株,为进一步研究PD-L1在胰腺癌进展中的机制奠定了基础. 参考文献 Nomi T,Sho M,Akahori T. Clinical significance and therapeutic potential of the programmed death-1 ligand/programmed death-1 pathway in human pancreatic cancer[J].Clinical Cancer Research,2007,(7):2151-2157.doi:10.1158/1078-0432.CCR-06-2746. Geng L,Huang D,Liu J. B7-H1 upregulated expression in human pancreatic carcinoma tissue associates with tumor progression[J].Journal of Cancer Research and Clinical Oncology,2008.1021-1027. Loos M,Giese NA,KleeffJ. Clinical signicance and regulation of the costimulatory molecule B7-H1 in pancreatic cancer[J].Cancer Letters,2008,(1):98-109.doi:10.1016/j.canlet.2008.03.056. Fumiya H,Katsumi K,Hideto T. Blockade of B7-HI and PD-l by monoclonal antibodies potentiates cancer therapeutic immunity[J].Cancer Research,2005.1089-1096. 邱志兵,陈鑫,段超. 靶向STAT3的慢病毒表达载体的构建及其对血管平滑肌细胞增殖凋亡的影响[J].中华实验外科杂志,2011,(4):506-509.doi:10.3760/cma.j.issn.1001-9030.2011.04.009.
