激素对人骨髓间充质干细胞凋亡及神经肽受体基因表达的影响
发表时间：2014-12-11 浏览次数：1080次
自Pietrogrand报道激素诱发股骨头坏死(ONFH)以来,世界各地陆续出现类似病例的报道.近年来是导致激素性ONFH的原因}3J;与此同时,骨的代谢、发生、发育、修复和功能发挥上的神经调控作用也日益受到重视〔4J.本研究旨在观察激素对人骨髓间充质干细胞(hBMSCs)的凋亡相关基因及神经肤基因表达的影响,探讨激素性ONFH的发病机制. 材料与方法 1.材料:随机选取健康志愿者12例,其中男6例, 女6例,平均年龄46.3(43一49)岁,排除股骨头坏死及乙醇、激素、外伤等骨坏死易感因素史二无菌条件下抽取志愿者骨髓血5一10ml.双抗LG-DMEM培养基(Gibco公司),胎牛血清(FBS,PAA公司),地塞米松(Sigma公司),人淋巴细胞分离液(上海华精公司),胰蛋白酶(北京吉诺公司),细胞计数板(上海求精公司),鼠抗人CD29,CD34,CD44,CD45,CD90(PHarM-ingen公司),Trizol-离心柱tRNA提取试剂盒(上海捷瑞公司),逆转录试剂盒、SYBRGreenqPCR试剂盒(Fermentas公司),实验检测指标mRNA的引物以及内参价actinmRNA引物(上海生工生物公司),C0,培养箱(Sanyo公司),倒置显微镜(Olympus公司),离心机(Eppendorf公司),流式细胞仪(BectonD公司),超净工作台(苏州净化公司),紫外分光光度仪(GE公司),梯度聚合酶链反应(PCR)仪、荧光定量PCR仪(ABI公司),UVP凝胶成像分析系统(BioSpectrum公司). 2.hBMSCs的分离培养及传代:无菌条件下抽取志愿者骼后上棘骨髓5ml注人密封无菌抗凝管中,加人0.5ml肝素抗凝,1000r/min离心5min,以去除脂肪和骨膜等组织细胞,在超净台内用无菌注射器抽取不含FBS的LG-DMEM培养液,吹打均匀后缓慢铺于等体积的Ficoll淋巴细胞分离液(密度为1.077g/ml)之上,2000r/min离心20min,缓慢抽取液面交界环状白色单核细胞云雾层(hBMSCs细胞层),用不含FBS的LG-DMEM培养液洗涤2次,吹打混匀后加人含体积分数15%胎牛血清(FBS)LG-DMEM培养基,计数后调成1x10'0/L接种于25c耐培养瓶中置于370C,5%COZ饱和湿度的培养箱中培养,2d后首次换液,弃除未贴壁的细胞,以后根据细胞生长情况2-3d换液,隔日倒置光学显微镜下观察细胞形态及生长.当细胞铺满瓶底90%左右,呈成细胞纤维样,接近融合生长时,用0.25%胰蛋白酶37℃消化传代,使用细胞计数板镜下计数,以1x10'0/L接种于25c澎培养瓶中,按1:2或1:3的比例传代培养后,每2}3d换液,待细胞铺满瓶底90%左右时再重复操作至第3代细胞. 3.hBMSCs的鉴定:目前常用的hBMSCs所表达的表面分子标志物有CD29,CD44,CD90等,阴性分子标志物有CD34,CD45等「5.将培养的第3代hBMSCs,0.25%胰蛋白酶消化、离心,磷酸盐缓冲液(PBS)清洗细胞3次,计数细胞为1x10'0/L,各管依次加人CD29,CD34,CD44,CD45,CD90,同时每管样品设立同型阴性对照避光冰上孵育45min,用PBS洗涤细胞3次,以去除未结合抗体,用500浏PBS重悬细胞,流式细胞仪进行检测分析〕. 4.细胞分组和诱导:当hBMSCs稳定传至第3代后,随机分为实验组与对照组.实验组在培养液中加人地塞米松,维持浓度为1x10-'mol/L;对照组正常培养. 5.细胞总RNA提取、纯度测定及cDNA的合成: 收集实验组、对照组第7天的细胞,采用Trizol法提取总RNA,逆转录合成cDNA. 6.实时定量一聚合酶链反应(RT-qPCR)定量分析: 用}TBRGreen法检测以下各基因表达水平.半胧氨酸天冬氨酸蛋自酶-3(Caspase-3):正义链5'-TGGTC-TACCTCTACCACATTCC-3',反义链5'-AGCGACTCA-AACTGCCCTCCTG-3';B淋巴细胞/白血病一2(bcl-2)正义链5'-CGACTT"1'GCAGAGACGTCCA-3',反义链5'-ATGCCGGTTCAGGTACTCAG-3';(3一肌动蛋白([3-actin):正义链5'-}GaGCCTCGCCTTTGCCGATCC-3',反义链5'-CACATGCCGGAGCCGTTGTCG-3';降钙素基因相关肤受体(CGRPR):正义链5'-TGCGCT-TCTCAGTAACTACGAG-3',反义链5'-CAGGACTCTG-GTGCCTGCATGG-3';P物质受体(SPR:正义链5'-ACGAGCAAGTCTCTGCCAAGCG-3’,反义链5’-GGCA-TGCTTGAAGCCCAGACGG-3';过氧化物酶体增殖子活化受体叭PPARy):正义链5'-ACCCAGAAAGCGA-TTCCTTC.}CTG-3',反义链5'-GCTGATCCCAAAGTT-GGTGGGCC-3';Runx2:正义链5'-TCCCCGCCGTG-GTCCTATGAC-3',反义链5'-TTCTGAAGCACCT-GAAATGCGCCT-3'.扩增片段大小分别为118,149,106,248,167,207,195by;建立25p,1RT-qPCR反应体系二反应条件:95℃预变性2min,94℃变性30s,退火(依次为58,62,60,65,55,62,600C)30s,72℃延伸30s,40个循环,每个循环收集1次荧光,设为定量分析模式,检测相关基因的Ct值Ct值表示每个反应管内的荧光信号达到设定的I=}7值时所经历的循环数,每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数呈线性关系,起始拷贝数越多,Ct越小.采用2-ooc:}分析实验组与对照组之间各个基因的表达量变化. 7.统计学方法:数据均用均数士标准差表示,应用SPSS13.0统计软件分析.两组间比较采用t检验. 结果 1.hBMSC、形态学观察:倒置显微镜观察,细胞培养第1天后即有贴壁,生长较分散;2d时可见许多贴壁细胞伸展为多角形、梭形等,未贴壁细胞经换液冲洗后去除;5一9d后,贴壁细胞迅速增殖,体积增大,开始呈集落生长.至14d细胞已融合,呈成细胞纤维样,基本铺满平底的90%.传至第3代后,细胞呈均匀一致的长梭形,排列成旋涡状或放射状. 2.hBMSCs鉴定结果:流式细胞仪检测细胞表面 抗原显示,其表面分子标志物CD29,CD44,CD90呈阳性,CD34,CD45呈阴性,表明本研究所分离培养细胞为hBMSCs,3.RT-qPCR结果分析:实验组细胞在1x10mmol/L地塞米松诱导7d后,Caspase-3,PPARymRNA的表达较对照组明显升高,2-nnc,分别为5.99士2.00,6.93士0.70(P<0.O1);而bcl-2,CGRPR,SPR,Runx2mRNA的表达较对照组明显降低,2-ooc,值分别为0.20士0.51,0.11士0.02,0.28士0.08,0.13士0.21,两组差异有统计学意义(P<0.01,表1)讨论正常骨组织中存有大量的自主神经和感觉神经,因其通过神经末梢分泌多种神经肚作用于骨组织,故又称其为肤能神经.近年来,神经系统与骨的生长、修复与重建之间的密切联系逐渐被研究证实,有多种神经肤因子参与骨细胞的代谢和修复过程;其中CGRP可以促进成骨细胞的分化和增殖,而SPR与CGRP伴行,同样具有促进成骨细胞的分化和增殖的作用. 研究结果显示,PPAR,广泛存在于人体内,在成脂分化过程中起着正反馈调控的作用,是成脂分化的重要调控因子{Rj,而其活化通常伴随着Runx2的抑制作用,Runx2是一种成骨细胞相关的基因,在hBMSC、成骨分化及成骨细胞合成骨组织的过程中均起到了关键作用[9.本实验中,地塞米松作用hBMSCs7d后,实验组中CGRPR,SPR,Runx2mRNA明显降低,加之PPARymRNA表达明显上调,将大大抑制hBMSCs的成骨分化,促进其成脂分化,减弱了成骨修复能力.提示激素抑制神经肤、Runx2等成骨基因表达,促进成脂基因PPAR,的表达,可能与ONFH的病理过程密切相关. 有研究表明有大量的凋亡细胞存在于激素性 ONFH的骨组织中,提出了激素性ONFH的骨细胞凋亡学说;暴淑英等.通过动物实验进一步证明了此学说,并提出bcl-2和Caspase-3可能与激素性ONFH的细胞凋亡有关,而在细胞体外培养坏境中,激素对hBMSCs中bcl-2,Caspase-3表达的影响,尚待进一步探讨本研究中,hRMSC、在地塞米松作用}a后,Caspase-3mRNA呈高表达,而bcl-2mRNA呈低表达,表明激素能够通过Caspase酶级联反应,启动hBMSCs的凋亡,可能促进ONFH的发生与发展. 本实验结果表明,在激素诱导作用下,hBMSCs中 PPAR}y,Caspase-3mRNA呈高表达,导致细胞成脂分化,促进细胞凋亡;bcl-2}CGRPR,SPR,Runx2mRNA呈低表达,抗凋亡能力减弱,并抑制细胞成骨分化,降低骨修复能力.激素诱导这些基因的变化可能与ONFH的发生机制有关,尚有待进一步研究. 参考文献 Hofmann S,Mazieres B. 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