影响胃肠间质瘤完全切除术后复发转移及预后的相关生物标志物研究

　　由于胃肠间质瘤(gastrointestinalstromaltumor,GIST)发病机制的不恒定性，其生物学行为谱较广泛，在临床上表现也多种多样。虽然目前一致认为，根治GIST的唯一方法是手术治疗，但GIST即使完全切除术后仍有40%0一90%的复发转移率‘ZJ。在GIST的相关研究中，除kit和PDGFRA基因突变检测已在临床用于协助诊断外，国内外近年来陆续报道了一些其他影口向GIST预后的生牛细示态物，但研究多不系统，样本量较少，结果也不统一。本研究选取I}1-67、E-cadherin,CD44,nm23、环氧化酶-2(cyclooxygenase-2,COX-2),VEGF,P53,Survivin,CyclinD1和基质金属蛋白酶7(matrixmetalloproteinase7,MMP7)共10个生物标志物，利用免疫组织化学(免疫组化)技术、以组织芯片为载体，分析其与GIST完全切除术后复发转移及预后的关系，为临床诊治提供参考。　　资料与方法　　一、一般资料　　1990年1月至2008年12月间共有337例GIST患者在中山大学肿瘤防治中心接受完全切除手术，其中174例能获得病理蜡块;制作组织芯片，剔除组织芯片免疫组化染色后存在的掉片，最终148例患者纳人本研究。其中男92例，女56例，年龄2681(中位56.5)岁。肿瘤直径。.425.0中位6.5)cm。肿瘤位于食管3例(2.0%)，胃79例(53.4%)，十二指肠8例(5.4%)，空回肠44例(29.7%)，结肠4例(2.7%)，直肠10例(6.8%)。按1}IH分级，高危险度74例(50.0%)，中危险度16例(10.8%)，低危险度21例(14.2%)，极低危险度37例(25.0%)。同时伴有食管癌15例，胃癌10例，乙状结肠癌、直肠癌和前列腺癌各1例。本组病例末次随访日期为2010年12月31日，随访率99.3%(147/148)。中位随访时间为38.0(13182)月，随访2年以上者105例(71.6%)。　　二、组织芯片制作　　对照每例GIST的苏木精一伊红染色切片，在代表性的肿瘤区域，取3个点，用组织芯片仪MINICORE(Alphelys)在标记处穿取组织芯(每例3条，直径1.0mm)，并按设计的阵列方式依次插人受体蜡块中，制成组织芯片。　　三、免疫组化染色　　用已知组织表达抗体为阳性对照，阴性对照以PBS代替一抗。不同抗体购自公司、浓度、阳性对照标本及染色部位见表1。检测结果由两名病理医师阅片判断，染色结果判断标准如下:　　1.Ki-67提判断采用标记指数(LabelingIndex)在40倍物镜下，计数5001000个肿瘤细胞中的阳性细胞数，求出平均每100个细胞中的阳性细胞数，记为Ki-67指数。阳性率以中位数5%为界值，分为成小于或等于5%和大于5%两组。　　2.E-cadherin,CD44和CyclinD1:根据阳性肿瘤细胞占所观察同类细胞的百分率及显色深浅采用半定量积分法分级:(1)显色深浅:不显色为。分，浅黄色为1分，棕黄色为2分，深褐色为3分;(2)阳性细胞百分率:未见阳性细胞数为。分，小于或等于25%为1分，26%a}75%为2分，大于75%者为3分(3)两项相加:小于3分为阴性，大于或等于3分阳性3.P53:根据阳性肿瘤细胞占所观察同类细胞的百分率，半定量判断结果。以10%的阳性率为临界值，分为小于或等于10%(低表达)和大于10%(高表达)两组。　　4.MMP7,nm23,Survivin,COX一2和VEGF:参照RemmeleandStegerde的IRS(Immuno-reactiveSeore)记分法，即3个参数半定量记数方法:每张切片随机选取10个高倍镜视野,(1)计数阳性细胞数:阳性细胞数小于5%为。分，5%}30%为1分，31%}60%为2分，大于60%为3分;(2)阳性细胞的着色强度:淡黄色为1分，黄色为2分，棕黄色为3分;(3)两项积分相乘:0分为阴性，1分为弱阳性，2}4分为阳性，大于4分为强阳性。　　四、统计学方法　　采用SPSS16.0软件进行统计学分析，各项生物标志物与复发转移的关系采用才检验(Spearman相关分析)。单因素生存分析采用Kaplan-Meier法和Log-rank检验。采用LogisticCo、比例风险模型(后向逐步法一依然比)进行复发转移和生存的多因素分析，仅单因素分析有统计学意义的变量进人多因素分析模型。　　结果　　一、各生物标志物与GIST复发转移的关系　　148例患者中有52例存在术前转移或术后复发，单因素分析显示，除COX-2和CyclinD1外，其余8种生物标志物均与复发转移有关;见表2。　　二、单因素预后分析　　Log-rank检验结果显示，Ki}7,E}adherin,MMP7、CD44,P53和Survivin与本组GIST患者术后无瘤生存有关;Ki-67,E-cadherin,P53和Survivin则与术后总体生存有关。见表30三、多因素预后分析将上述单因素预后分析中有统计学意义的变量纳人Cox回归模型进行多因素预后分析，结果显示，Ki-67,CD44和P53是影响本组GIST患者术后复发转移的的独立因素，Ki-67是影响术后生存的独立因素。见表4。　　讨论　　Ki-67和CyclinD1均位于细胞周期调节的关键位点上。Ki-67指数是细胞增殖核抗原的指标，能反映细胞的增殖活性，并与肿瘤的恶性程度、浸润、种植、转移相关。Ohsie等.研究认为，Ki-67与结直肠癌、乳腺癌和食管癌的恶性程度、种植、浸润、转移相关，检测Ki-67标记指数可反应肿瘤细胞增殖活性并评估它们的恶性度。在GIST研究中，已有的国内外结果较一致，都支持Ki-67指数可作为反映GIST肿瘤恶性潜能的指标5-56;并认为其与GIST患者的预后有关’}--Ki-67指数的界值在4.92%}22%之间，多数以10%为界划分两组研究，但对于如何界定I11-67标记指数，并无一致的标准一9。本研究以Ki-67标记指数的中位数5%为界，分为两组，观察到Ki-67标记低指数组的无瘤生存率和生存率显著优于高指数组，支持Ki-67指数与复发转移、预后相关。另有多项研究显示，Ki-67可以作为GIST的复发转移和预后的独立因素9-10。尽管Ki-67指数与核分裂像都能反应细胞的增殖度，有一定的对应性，但Ki-67指数更客观、准确，可能预后价值更高。尽管许多学者已将Ki-67指数作为GIST的重要预后观察指标，但Ki-67能否取代目前通行的Fletche:和Miettinen恶性危险度分级中核分裂像计数的地位，有待分组的临界值统一后在大样本的多中心临床研究进一步探讨。原癌基因CyclinD1表达越强，细胞分裂也快，而促使肿瘤的发生。有研究观察到与GIST的复发转移密切相关，随恶性度的增加，表达量越强。本研究未得到相关的结论，仅观察到这样的趋势。　　Survivin即生存素基因，属抑制凋亡基因家族(IAP)，是分子量最小而抗凋亡作用最强的凋亡抑制基因，其表达的生存素蛋白在细胞质中可观察到生物学功能包括干扰细胞周期，抑制凋亡，促进细胞增殖、分裂，参与血管生成等.还能对抗各种凋亡诱导因子。有研究支持Survivin可能作为判断GIST肿瘤恶性危险度的指标之一’2。本组也观察到Survivin高表达与复发转移有关，并与GIST的无瘤生存率和生存率有关。P53属于抑癌基因，其肿瘤谱广，是与人类患肿瘤相关性最高的抑癌基因。多项研究显示，GIST也存在P53基因的突变，其表达的蛋白积累在GIST的恶性进展中起作用，其阳性率随GIST的恶性风险度的增加而升高，促进GIST细胞出现增殖，并恶性转化，其蛋白表达的变化可以成为评估GIST恶性危险度分级的指标。本研究根据多数研究采用的标准，以10%为界，结果显示，P53高表达与复发转移和生存有关，但经多因素分析却并未显示其可作为GIST术后复发转移和生存的独立影响因素。所以我们认为，P53蛋白的表达可能同复发转移相关，要据此判断术后GIST的预后，确要进一步研究证实。　　侵袭性和转移性是恶性肿瘤细胞的重要生物学特征，而细胞勃附作用在肿瘤细胞的侵袭、转移过程中有重要作用。本研究对与肿瘤复发转移密切相关的豁附蛋白分子包括E-cadherin和CD44进行研究，结果显示，其与GIST术后复发转移有关，同时E-cadherin还能影响术后生存。作为跨膜糖蛋白的茹附分子CD44蛋白家族在各种类型细胞中均表达，与病程和预后有关，它们参与了细胞间、基质和细胞间的相互作用以及细胞的运输等活动，在肿瘤转移、局部浸润中可能起到一定的作用，如果表达降低则代表细胞间的戮附性差，符合肿瘤细胞脱落转移的机制。但目前研究CD44与GIST预后是否相关有争议。E-cadherin是一种细胞膜整合蛋白，通过介导同型细胞的戮附功能，起抑制肿瘤细胞转移的功能，如果表达缺失和下降，肿瘤细胞易外侵和转移。国内外研究认为，E-cadherin是GIST早期复发的独立预后因素，可作为预测术后复发转移的指标。本研究的结果与之相符。　　nm23是一种转移抑制基因。Kanat等研究发现，高表达nm23的肿瘤转移潜力明显下降，nm23高表达的患者的中位生存时间明显长于低表达或未表达者，支持nm23表达可以作为GIST的一个预后指标。但本研究显示，nm23与GIST术后无瘤生存和总体生存均不相关。另一个与侵袭转移相关的是基质金属蛋白酶家族(MMPs)，是细胞外基质(ECM)降解最重要的蛋白水解系统。国内也有研究报道，MMP7表达与GIST生物学行为相关，伴随GIST的Fletche:风险度升高，MMP7表达也升高，有利于胞外基质降解而促进GIST的浸润性生长和转移，而且其高表达可以导致GIST浸润性生长加速，表明其可能是GIST恶性程度增加、生长活跃和转移的有价值的检测指标之一Zo,0本研究也观察到MMP7与复发转移相关，但与生存率无关。　　关于COX-2和VEGF在GIST中的研究，大多显示与肿瘤的恶性风险度和预后相关，并认为COX-2是通过调节VEGF的表达以促进GIST浸润和转移21-23。本组COX-2的阳性率为60.8%，明显低于相关报道的76%}92%-2z-z3;且与GIST复发转移及生存方面也无明显关系。本研究还显示，VEGF与GIST术后复发转移密切相关，但与预后无关。这些都对VEGF作为GIST恶性风险度评估标准提出质疑，临床预后的生物标记指标的意义有限。　　总的来说，生物标志物的免疫组化检测方法简单实用，利用体积小、信息量高的组织芯片，一次性检测即可获大量数据，同一套组织芯片即可迅速对RNA,DNA和抗原等多种生物分子标记进行检测、分析，也能很好地控制检测质量，减少误差，结果可信度高。本研究对上述10个指标与GIST复发转移和预后关系的分析中，确实也观察到有效的指标，但同时也有一些结果与别的研究结果不符，提示生物标志物作为术后GIST的恶性风险度参考和预后指标的临床实用性有待进一步大样本多中心的深人研究。本研究也为下一步通过数据挖掘技术进一步寻找有意义的指标提供了前期的准备工作。　　参考文献　　Hassan I,You YN,Shyyan R. Surgically managed gastrointestinal stromal tumors:a comparative and prognostic analysis[J].Annals of Surgical Oncology,2008.52-59.　　Gold JS,Dematteo RP. Combined surgical and molecular therapy:the gastrointestinal stromal tumor model[J].Annals of Surgery,2006,(2):176-184.doi:10.1097/01.sla.0000218080.94145.cf.　　薄林会,刘文天. 胃肠道间质瘤预后研究进展[J].国际内科学杂志,2007,(6):335-338.　　Ohsie SJ,Sarantopoulos GP,Cochran AJ. Immunohistochemical characteristics of melanoma[J].Journal of Cutaneous Pathology,2008,(5):433.doi:10.1111/j.1600-0560.2007.00891.x.　　张飞功,刘瑞,陈丹磊. p53,p21WAF1,Ki-67及PCNA在小肠间质瘤的表达及其意义[J].中国普通外科杂志,2009,(4):406-408.　　Ozguc H,Yilmazlar T,Yeric O. Analysis of prognostic and immunohistochemical factors in gastrointestinal stromal tumors with malignant potential[J].Journal of Gastrointestinal Surgery,2005.418-429.　　黄文生,王天宝,伍虹. Ki-67和survivin蛋白在胃肠间质瘤的表达与临床意义[J].中华胃肠外科杂志,2011,(8):645-646.doi:10.3760/cma.j.issn.1671-0274.2011.08.025.　　Koon N,Schneider-Stock R,Sarlomo-Rikala M. Molecular targets for tumour Progression in gastrointestinal stromal tumours[J].Gut,2004.235-240.　　Huang HY,Huang WW,Lin CN. Immunohistochemical expression of pl6IK4A,Ki-67,and Mcm2 proteins in gastrointestinal stromal tumors:prognostic implications and correlations with risk stratification of NIH consensus criteria[J].Annals of Surgical Oncology,2006.1633-1644.　　Nilsson B,Bumming P,Meis-Kindblom JM. Gastrointestinal stromal tumors:the incidence,prevalence,clinical course,and prognostication in the preimatinib mesylate era (a population-based study in western Sweden)[J].Cancer,2005.821-829.