VEGF靶向荷钆PLA-PEG-PLL纳米探针的制备及其在小肝癌成像中的价值

影像学技术是诊断肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)的重要手段。但是，在微小病变的定位和定性诊断方面，传统影像学的诊断敏感度较差。这已成为目前制约肝癌诊治的主要瓶颈。近年来，特异性靶向分子成像技术为解决这个难题提供了可能之。大量内皮细胞活化及新生血管生成是恶性肿瘤的共有表型川。即使病变很小，病灶内亦可表达足够的特异性标记物，如血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)等。将其作为成像靶点，利用相应的抗体制备分尹探针并进行成像，不仅解决了不典型小病灶的定性难题，还为一些隐匿性病灶的显示提供了可能。我们采用生物相容性高分子材料聚乳酸一聚乙二醇一聚赖氨酸(PLA-PEG-PI_I)制备荷午[纳米载体表面修饰antt-VEGF抗体后形成靶向纳米探针，探讨了该探针在旱期肝癌MR成像中的价值。

材料与方法

1.VEGF靶向PI_A-PEG-PI_I.纳米探针的制备及性质考察:采用我们前期研究的方法几，首一先合成高分子材料PLA-PEG-P I工((13 000-2000-2500),将二乙基三胺五乙酸(DTPA)环纤连接于PI工嵌段的活性氨基上得到PI_A-PEG-P工L。然后取适量聚合物溶于二甲基甲酞胺(DMF)，在磁力搅拌下滴加人水中，透析除去游离的DMF后即得到表面修饰有DTPA基团的纳米粒加人过量的〔}dCl溶液，室温搅拌1h后产物避光透析，直至用4-2一毗陡偶氮关间苯二酚检测不到游离礼.得到Gd修饰纳米粒将纳米粒中加人适量戊二醛,15 000:mm离心弃去上清，使用双蒸水复溶后与}0川VE(TF抗体4 0C孵育12 h，即得抗体一荷礼标记纳米探针非靶向探针在制备时未连接VEGF抗体电感偶极等离子发射光谱法测定其中礼浓度。血浆稳定性考察:靶向及非靶向纳米探针加至200川50%人血浆中，水浴恒温振荡。于。h,0.5 h,1 h,2 h,4 h取样品离心弃上清，双蒸水复溶后投射电镜观察探针形态学的变化。

2.MR实验及检测指标:(1)肝癌动物模型的建立:将肝癌细胞系H22细胞接种于小鼠腋部皮下(1X106,0.1 m1),14 d后成瘤备用。取荷瘤小鼠模型6只，随机分成2组(每组3只)，即靶向探针组和非靶向纳米粒组。另腹股沟皮下接种建立小肝癌模型3只，接种Jd后进行MR成像。(2)MR扫描:体外MR成像取靶向荷扎纳米探针稀释成序列浓度:0.5}1.0,2.0}4.0,8.0}cmol/ml，另将100}mol/ml的Gd-DTPA及双蒸水分别作为阳、阴性对照。先进行T1 map扫描(TE 15 ms,TR 167,300,600,900,1200 1500,1800,2500,3500 ms)，再传人ADW4.2工作站得到Tl值，然后计算驰豫率Rl(R1=1/Tl>。小鼠模型水合氯醛麻醉后常规保温，固定于俯卧位。

利用绷带束紧小鼠上腹部以尽可能减少呼吸伪影。常规T1WI(SE序列，TR 500 ms,TE 8 ms，中心频率19.2 kHz,FOV 25 mmX 19 mm,矩阵320 X 192,}1EX 2，层厚2 mm,pa]隔1 mm),T2 WI C FSE序列，偏转角900,TR 4500 ms,TE 11 ms，中心频率31.2 kHz，层厚2 mm.间隔1 mm,FOV 25 mmX15 mm，矩阵256X448,NEX 2)图像采集后再进行动态增强扫描。各组分别经尾静脉注射40mol;%kg的靶向探针、非靶向纳米粒及Ua-nTPA。注射对比剂的同时进行MR扫描。在3.OT磁共振扫描仪下使用8通道头线圈进行扫描，扫描为冠状位动态增强扫描采用3-D FAME序列(FSPGR序列，偏转角200,TR 8.2 ms,TE 2.4 ms，中心频率62.}kHz,层厚2 mm,0间隔，F()V 19 mmX15 mm，矩阵256 X 192,VEX 1)。

最初5 min内无间隔重复动态扫描，每次扫描时间6s。此后扫描时间点为10 min,20 min,30 min,45 min,1 h、1.5 h、2h、2.,>h,3 h、3.5 h、4h、8h。观察病变的增强表现特点。结果1.靶向纳米探针性质检测结果:透射电镜显示制备的纳米粒呈球形或类球形，外观圆整.分布均匀，分散性好非靶同纳米粒平均粒径为(69.8士5.3)nm,靶向纳米探针则为(85.8士7.2)nm>Zata电位分别为(23.03士}.6)mV及(21.63士2.4)mV0电感偶极等离子体发射光谱法测定靶向探针礼浓度为6}mol;'ml，非靶向纳米粒则为9 j}mol/ml。血浆稳定性考察显示各时间点纳米粒分布均匀，分散性好.无聚集现象。

2.MR显影:体外MR显影显示靶向探针的驰豫率与浓度呈线性关系(图1)。当靶向探针浓度为8.0}mol/m1时Rl值为18.394 mmol"ml‘一土。体内MR成像显示靶向探针增强扫描显示皮下种植的较大肿瘤呈现典型的延迟期强化。强化峰值在Zh时出现，8h后信号儿乎消失(图2>。而非靶向纳米粒增强扫描显示肿瘤强化不明显(图3)。小肝癌模型MR成像也显示小病灶明显延迟期强化，强化峰值出现在3h,4h后信号变弱，8h后强化消失(图4)0讨论我国肝癌的发病率居世界首位。目前提高其疗效的主要方法是早期发现、早期治疗，但常规影像学技术在超早期肝癌的检测方面面临严峻挑战。研究证实，对于<1 cm的肝癌，MR敏感度仅为2900^4300}`0。结节越小，影像学表现越混乱。肿瘤的发生、发展依赖其内新生血管的生成工。尽管恶性肿瘤内血管数目增多，但有灌注功能的血管的比例<5 0 o C0J，其余95%为不成熟的血管。这表明对于无典型影像学特点的小肝癌而言，其内也存在大量活化、增殖的内皮细胞。因此与其相关的标记物(如VEGF等)的表达亦非常丰富，理论上可以作为小肝癌成像的理想靶点H22移植性肝癌细胞表达较高水平的VEGF，因此本研究选择VEGF为靶点制备靶向PLA-PEGPI工、荷礼纳米探针。研究表明1.5 cm或更小的肝癌常表现为等信号(密度)。

而且我国肝癌患者普遍并发的肝硬化、铁沉积背景亦使超顺磁性氧化铁颗粒(SPIN))在小肝癌检测方面的价值大打折扣扎鳌合物TI增强效应驰豫时间长、解剖图像好、空间分辨力和信噪比高，而伪影更少匕，因此更适于小病灶的显像。但是，含礼探针的合成难度相对较大万川。纳米探针的效率必须兼顾显影和连接抗体的数量，因此纳米粒应具备更多的活性基团以利于连接更多的外接化学分子。在本研究PI_A-PEG-PI_L是用端氨基PI_A-PEG做引发剂，赖氨酸上的:-NH2具有更多的活性氨基。本研究制备的靶向探针浓度为8,umo1/ml时一其信号强度与40 umol/ml的Ga-DTPA注射液一致，显著提高了驰豫率。同时，为避免体内网状内皮系统对纳米粒的非特异性吞噬，纳米粒应保持较小的粒径。本研究制备的纳米粒均小于100 nm。另外，纳米粒中的聚乙二醇(PEG)可增加纳米粒的水溶性.并产生“隐形”效应，避免网状内皮细胞吞噬，延长在血液中的半衰期1在荷瘤小鼠的MR实验中，靶向礼基纳米探针表现出非常好的特异性强化效果.特别在小的皮下种植瘤实现了特异性靶向成像。这也提示VEGF靶向针基纳米探针可能在微小病灶的检测方面具有重要的意义。总之，本研究成功制备了高驰豫率的VEGF靶向PLA-PEG-PLI一荷礼纳米探针，并实现了皮下种植小肝癌的特异性成像，展示出较好的临床应用前景。但靶向探针在肝脏原位肿瘤中的成像效果及其药物动力学机制、及其免疫学、毒理学影响需要进一步探讨。

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