白介素1受体拮抗剂壳聚糖纳米颗粒联合骨髓间充质干细胞移植治疗急性肝衰竭的实验研究

骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)具备强大的可塑性，能在体外分化为包括肝细胞在内的多种成体细胞，有望成为各种组织损伤甚至衰竭的替代疗法。但移植干细胞的体内存活率及转化率很低[[5]。静脉输注MSCs培养基能明显减轻D-氨基半乳糖所致肝细胞死亡，促进组织再生，提高移植细胞存活率[}6]o MSCs还具有在体内外分泌肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor,HGF)、血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)和基质细胞衍生因子1等营养因子、免疫调节因子和趋化因子的功能[},]白细胞介素1受体拮抗剂(interleukin 1 receptor antagonist,IL-1Ra)能阻断白细胞介素1(IL-1)弓}发的细胞内信号传导，起到抗炎效果[fa-9]若在MSCs移植的同时给予工L-1Ra治疗，改善肝脏内环境，提高移植细胞存活率，将会给急性肝衰竭(acute liver failure,ALF)的治疗带来诱人前景。但由于工L-1Ra价格昂贵，而其实际应用剂量又比较大，明显提高了其临床应用的成本。另外，由于工L-1Ra在血液中的半衰期很短，需要反复、长期用药以维持疗效，不便于临床应用。因此，研制缓释系统控制IL-1 Ra释放，提高其生物利用效率极为必要。近年来，由于壳聚糖的生物相容性和生物可降解性好，无不良反应，被广泛用作药物载体和医用材料，制备包裹工L-1Ra的肝脏靶向壳聚糖载体不失为较好的选择。本研究旨在制备工L-1Ra乳糖酸基壳聚糖纳米颗粒，探讨其联合同种异体MSCs移植对ALF猪的协同治疗作用，并初步探索其机制。

资料与方法

一、材料中华实验小型猪34头，雌雄不限，体质量10 kg，由南京大学医学院附属鼓楼医院实验动物中心提供。L-DMEM墙养液、特级胎牛血清、胰蛋白酶购自美国Gibco公司，淋巴细胞分离液购自天津TBD公司，稳定表达绿色荧光蛋白(green fluorescence protein,GFP)的猪骨髓MSCs细胞系购自上海生博医学生物工程科技公司，抗猪CD44-APC单克隆抗体、CD45单克隆抗体及兔GFP抗体购自美国Abcam公司，抗猪CD90-PE单克隆抗体购自美国BD公司，抗猪Ki67单克隆抗体、抗猪HGF购自美国Santa Cruz Biotechnology公司，抗猪VEGF购自美国Thereto Fisher公司，猪工L-1日、肿瘤坏死因子二(TNF a)和工L-6 ELISA试剂盒购自美国Life Science公司;rh工L-1Ra购自中国科学院过程工程研究所，异硫氰酸荧光素(FIT C)购自美国Sigma公司，FITC一工L-1Ra乳糖酸基壳聚糖纳米颗粒由东南大学公共卫生学院提供。

二、实验准备

1.流式细胞仪(FCM)检测GFP示踪的MSCs情况:慢病毒转染的GFP-MS Cs细胞系在常规条件下培养，待铺满培养瓶后胰酶消化，以106个/mI制成磷酸盐缓冲液(PBS)悬浮液，FCM检测MSCs绿色荧光表达率和荧光强度。

2.荧光显微镜观察纳米颗粒体外肝细胞靶向胜:将分离好的肝细胞和MSCs以5X106个/孔的密度分别分装于六孔板中，每孔预先放置无菌盖玻片。体外培养24 h后，将溶于PBS的FITC标记的乳糖酸基壳聚糖纳米颗粒按每孔2耐滴加到两组六孔板中，再分别加滴2 ml RPMI 1640和DMEM培养基，37℃培养箱中共同孵育24 ho 95%乙醇4℃固定30~，4,6一二眯基一2一苯基叫睬二盐酸盐(DAP工)染细胞核，避光条件下荧光显微镜观察细胞染色情况。同时，FCM分析靶向细胞比例和荧光强度。

3.ELISA法检测体内肝细胞靶向性:0.1 mg工L-1 Ra采用静电喷射法制备成乳糖酸基壳聚糖纳米颗粒后溶于100 ml PBS,10只SD大鼠尾静脉注射5 ml上述溶液，24 h后处死，每只取同体积的心、肝、肾组织(约0.5 cm3)和0.5 ml血液，分别研磨后溶于5耐PBS,ELISA法检测工L-1Ra浓度。

4.EL工SA法检测纳米颗粒体外缓释功能:静电喷射法制备出3份IL-1Ra乳糖酞基壳聚糖纳米颗粒A1,A2,A3，分别置于5 ml PBS中进行体外释放，在摇床摇速为40 r/min,37℃水浴，不同时间点分别取出1 ml释放溶液，同时补充1 ml PBS，将所取出的释放溶液于玻璃管中一20℃保存，标本收集后分别将原液稀释10倍、100倍，ELISA检测不同稀释液不同时间点释放溶液的工L-1Ra浓度，并计算相应时间点溶液中的工L-1Ra累积释放量。

三、实验疗效及机制探讨

1.实验模型的建立、分组及处理:所有动物在25℃环境下适应3d后建模。D-Gal按10%的浓度溶于50 g/L葡萄糖溶液，并调节溶液pH值至6.8，以0.3 g/kg剂量经耳背大静脉注射到试验猪体内;造模24 h后分别行GFP-MSCs门静脉移植手术和等渗盐水假手术，术后3d抗感染治疗。所有动物建模后通过简单随机化的方法分为5组:造模讨照组(A组，二=6),IL-1Ra组(B组，二=7),MSCs组(C组，二=7),IL-1Ra联合MSCs组(D组，二=7)和工L-1Ra纳米颗粒联合MSCs组(E组，二=7)。各组诱导24 h后，A组剖腹门静脉注射等渗盐水40 ml,B组在等渗盐水注射前按1 mg/kg剂量从耳背大静脉注人工L-1Ra,C组剖腹门静脉注射MSCs悬液40 ml(约含细胞8 X 10'个)，D组和E组在细胞移植前按1 mg/kg剂量从耳背大静脉分别注人IL-1Ra和IL-1Ra纳米缓释颗粒，6h后门静脉移植MSCs细胞悬液40 ml。术前、术中、术后1一5d和1一4周定期抽血检测肝功能、炎症因子(工L-1口、TNF a和IL-6)变化，B型超声显示治疗1周时各组腹水情况。

2.肝脏细胞增殖情况:在第3天和第1,2,3,4周分别取肝组织做石蜡切片并行Ki67免疫组织化学染色，随机选择6个高倍视野，计算肝脏细胞增殖数目，计算各组每个时间点平均值，观察各组肝脏细胞的动态增殖情况。

3.GFP-MSCs移植后的分布及功能发挥情况:各组在细胞移植后2周末取肝组织做石蜡和冰冻切片，石蜡切片采用抗GFP第一抗体行免疫组织化学染色后在普通光镜下观察移植细胞分布情况，冰冻切片在荧光显微镜下直接观察GFP阳性移植细胞分布情况。与此同时，对第2周末肝组织行CK18免疫荧光染色，观察移植细胞的肝细胞转化情况;Western blot检测各组肝组织每100,u g蛋白中HGF和VEGF含量，探索移植干细胞体内分泌功能。

四、统计学方法实验结果用均数士标准差阮士表示采用SPSS16.0统计学软件进行数据处理，组间比较应用独立样本t检验(经Levene方差齐性检验，当P}0.1时，采用校正t检验)，P<0.05为差异有统计学意义。

结果

一、实验准备

1.GFP-MSCs细胞系成功构建:慢病毒介导GFP蛋白转染MSCs,漂吟霉素筛选装载有目的基因的细胞系，常规条件培养28 d后细胞增殖速度明显增快，成功铺满瓶底后，FCM检测，MSCs细胞系GFP表达率高达97.5%，并持续高荧光强度，提示GFP成功转染MSCs并能较长时间稳定表达。

2.工L-1Ra乳糖酸基壳聚糖纳米颗粒体外肝脏靶向性研究:成功构建工L-1Ra乳糖酞基壳聚糖纳米颗粒，红外光谱仪及该磁共振仪进行结构表征，结果显示乳糖酸以酚基形式成功接枝纳米颗粒(图1)。在细胞层面上直接观察其肝靶向性(图2A,B)，结果显示MSCs均匀贴壁生长，但荧光显微镜下未见围绕分枝状MSCs的绿色荧光(图2C)，图2D中几乎所有肝细胞均靶向有绿色荧光的纳米颗粒。FCM分析发现，被靶向的肝细胞比例达到97.2%,荧光强度几何平均值较对照组高出近10倍，提示乳糖酞基修饰壳聚糖纳米粒建立配体一受体生物特异性识别系统并成功介导肝细胞靶向。

3.纳米颗粒体内肝细胞靶向性:ELISA检测结果显示，IL-1Ra在肝组织研磨液的浓度为(147.15士31.74)pg/ml，血清为(25.65士9.59)pg/ml，肾脏为(42.65士9.79)pg/ml，心脏为(46.58士10.18)pg/ml,几-1Ra在肝组织研磨液的含量明显高于血清中的含量，差异有统计学意义(t=13.446,P<0.05)，提示IL-1 Ra乳糖酚基壳聚糖纳米颗粒在体内同样具备靶向肝脏细胞的功能。

4.纳米颗粒凸显缓释效果:ELISA试剂盒检测不同时间点缓释溶液中工L-1Ra的浓度，并计算相应时间点溶液中工L-1Ra累积释放量，结果显示工L-1Ra乳糖酞基壳聚糖纳米颗粒在体外PBS溶液中包封药物呈缓慢释放过程:首先1一3h突释峰，主要由于赫附于纳米颗粒表面的工L-1Ra迅速溶于PBS形成;其次3一9h的平台期，可能原因为颗粒表面的工L-1 Ra逐渐减少加之纳米颗粒内部的工L-1Ra弥散量不足，造成工L-1Ra累积释放量较之前没有明显增加;第三为9一30 h快速释放峰;最后累积释放率趋于稳定。3组实验均显示工L-1Ra纳米颗粒经过两次快速释放后工L-IRa累积释放率在30%左右，还有大部分的IL-1Ra在纳米颗粒载体内，提示这一时期为纳米颗粒缓释的主要部分。

二、联合治疗协同效应I.肝功能改善情况:各组存活动物肝功能在2-3周基本恢复。与对照组比较，B组肝功能未见明显改善，C,D组血氨、总胆红素在部分时间点明显下降;C,D组间肝功能改善情况无明显差异。E组肝功能恢复情况好于C组和A组，见表to 2.B超观察1周时各组肝衰竭后腹水情况:E组仅少量腹水;C组中度腹水，测量最大腹水距离为3.97 cm;A组大量腹水，最大腹水距离为5.35 cmo只、联合治疗机制探讨

1.ELISA检测各组炎症因子的动态变化:各组同时间点血清工L-1,TNF二和工L-6检测结果显示，血清炎症指标均为造模24 h后迅速上升，短时间内到达高峰，持续数日后缓慢下降;其中对照组各炎症指标在3周末仍略高于术前水平，B,C,D组与A组比较，炎症水平有改善，但差异均无统计学意义。与A组比较，E组工L-1水平在术后第3天即明显下降，TNF二在1周后明显下降，而工L-6水平在各时间点均明显降低(图3)，显示纳米颗粒发挥良好的靶向和缓释效应，通过拮抗工L-1，并在更长时间内通过抑制TNF二来控制炎症内环境。

2.免疫组织化学染色:Ki67阳性表达细胞核着棕黄色，细小颗粒状，疏密不等。术后第3天起，各组肝细胞增殖速度迅速上升，1周时达到高峰，但各组间差异无统计学意义沪值均>0.05);A,B组增殖细胞数随后直线下降，第3周恢复正常增殖水平。E组虽有降低，但维持在较高水平，与对照组相比，差异有统计学意义(t=5.173,P G 0.01)0 C,D组变化在上述两组之间。见表20 

3.MSCs在肝脏的分布和存活情况:荧光显微镜直接观察猪肝组织冰冻切片，绿色荧光为阳性细胞，蓝色为DAPI特染的细胞核，可见2周末E组移植细胞数较C组明显增多，且前者肝小叶实质内可见散在分布的移植细胞，后者分布于小叶周围为主(图4);抗GFP免疫组织化学染色结果显示，转染GFP的移植细胞光镜下呈棕褐色，E组移植细胞广泛分布于小叶实质内，两种方法显示的移植细胞存活和分布结果一致(图5)。

4.移植MSCs体内分泌多种细胞因子:分布于肝脏的移植细胞(绿色荧光)并未同时显示红色荧光的CK18，提示移植细胞几乎不表达CK18，即不能证明移植细胞通过功能肝细胞转化发挥治疗作用。相反，MSCs移植各组肝组织HGF,VEGF的表达量明显高于A组，且以E组最多(图6)0讨论MSCs体内横向分化的可塑性可能参与了肝功能的修复和重构[Liz)。但以临床应用为最终目标的干细胞疗法的疗效函待进一步提高，Kim等以2 x 10“个脐带间充质干细胞移植治疗大鼠肝硬化，结果显示移植细胞主要分布于血管周围，未见成熟肝细胞转化，肝功能及肝纤维化指标无明显好转，与我们先前的研究结果一致。因此，移植干细胞体内活性及转化率太低可能是制约其疗效的原因之一。工L-1Ra主要通过竞争性结合工L-1R来阻断工L-1细胞内信号传递进而阻断器官组织的炎症级联反应。SgP01等[[13]将野生型和敲除IL-1Ra基因大鼠进行2/3肝切除，发现野生型在术后IL-1Ra升高，而IL-6,IL-1 p和MCP-1等促炎因子显著下降，肝细胞增殖率、细胞周期蛋白显著上升。但由于工L-1Ra存在价格昂贵、生物半衰期短等弱点，严重制约其临床应用。将工L-1Ra装载在具有良好生物相容性、可降解性和无毒性的壳聚糖纳米粒内缓慢释放或许是可行的选择[14]。

另一方面，乳糖酸基是肝细胞表面去唾液酸糖蛋白受体的特异性配体，承载着引导纳米颗粒特异性靶向到肝细胞表面的功能，去唾液酸糖蛋白受体介导途径是实现肝靶向最好方法。因此，乳糖酞基化的壳聚糖纳米颗粒装载的工L-IRa是理想的选择。本实验成功构建了工L-1Ra纳米颗粒并与MSCs移植联合治疗猪ALF，结果显示工L-1Ra(2 mg/kg)联合MSCs移植治疗对实验性肝损伤有显著的保护作用，且能持续促进肝细胞增殖(2一4周)。而工L-1Ra纳米颗粒联合治疗组在部分时间点的ALT,凝血酶原时间及白蛋白水平较其余组有明显改善，提示纳米颗粒明显提高两者联合疗效。纳米颗粒组工L-I水平在早期(第I周之前)有显著下降，TUF。在1周后明显下降，荧光显微镜观察到2周末有更多的移植细胞在肝内存活，并且肝细胞增殖数持续维持较高水平。提示工L-1Ra纳米颗粒发挥良好的靶向和缓释作用，通过拮抗IL-1，并在更长时间内抑制TNF a来控制炎症反应，促进移植干细胞的定居及增殖。MSCs移植在治疗各种组织损伤甚至器官衰竭中具有广阔的应用前景，但干细胞修复器官衰竭的具体机制目前仍有争议[o3-zo。在MSCs移植治疗肝衰竭方面，最早认为干细胞通过转分化作用来替代损伤坏死肝细胞，或通过细胞融合方式发挥作用，但最近的研究更加支持MSCs主要通过旁分泌/自分泌作用的观点.MSCs在体外能分泌可溶性物质、细胞表面分子以及细胞外基质，其中以VEGF,HGF、工GF-1和IL-6等可溶性物质研究最多在研究MSCs对急性肾损伤保护作用时就认为干细胞通过分泌细胞因子和生长因子发挥抗调亡，促分裂，免疫调节和促血管生成等肾保护作用。本课题组先前的研究结果也证实与单纯肝细胞组比较，MSCs存在的共墙养体系中，肝细胞形态维持、功能发挥方面均显著好转，且进一步证实MSCs分泌的工L-6是体外维持肝细胞形态和功能的关键可溶性分子之一.

MSC细胞培养上清液对于体外培养损伤的肝细胞有抑制调亡，延长肝细胞存活时间的作用[fzal;体内试验中静脉注射MSCs培养基明显减轻ALF时肝细胞变性、坏死和凋亡以及炎症细胞浸润等，显著提高肝细胞增殖率(对照组的3倍)并提高大鼠存活率[6]。本实验结果显示联合治疗组移植细胞存活率显著增加，但各组移植细胞均无明显肝细胞转化迹象，这一结果与Sato等[Use的观点类似，即不能证明移植细胞通过肝细胞转化发挥治疗作用。相反，我们检测同时间点的肝组织中HGF,VEGF的含量，结果显示细胞移植组均显著高于对照组，且以纳米颗粒组最高，说明干细胞治疗肝衰竭至少部分源于其分泌功能，且这种治疗作用受IL-1 Ra纳米颗粒的影响。因此研究MSCs的旁分泌功能及如何调节肝细胞及非实质细胞，对阐明MSCs移植治疗肝衰竭机制存在重要价值。综上所述，低剂量IL-1Ra纳米缓释颗粒联合MSCs移植具有较长时间内持续控制肝衰竭炎症反应，显著改善移植细胞分布及存活率，促进肝细胞增殖等良好治疗效果。移植干细胞通过自分泌和(或)旁分泌多种细胞因子可能是其治疗ALF的重要机制之一。

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