自身免疫性肝炎患者血清趋化因子水平与生物化学指标的相关性

自身免疫性肝炎(autoimmune hepatitis,AIH)是一种免疫介导的肝损伤，以肝组织内T淋巴细胞浸润、高v球蛋白血症、血清自身抗体阳性、具有人类白细胞抗原遗传背景、常伴发其他自身免疫性疾病和对免疫抑制治疗有效为特征川。尽管A工H的发病机制尚未完全阐明，但多项证据表明，遗传易感性、分子模型学说、自身反应性T淋巴细胞、调节性T淋巴细胞缺陷参与了自身免疫性肝损伤。近年来，已有学者关注了细胞因子在A工H发病过程中的作用，趋化因子是细胞因子的重要组成部分，可发挥免疫调节作用，在一定的条件下也可参与多种疾病的发生{2]。目前有关趋化因子在A工H病理损伤中的作用罕见报道。本研究以活动期(治疗前)和激素治疗后缓解期AIH患者为研究对象，探讨A工H患者外周血中趋化因子水平及其与生物化学指标相关性，为进一步探讨A工H的发病机制提供实验依据。

资料与方法

1.研究对象:46例A工H患者均为2008年至2011年北京佑安医院收治并临床确诊的病例，25例为活动期(治疗前)患者，21例为激素治疗后缓解期患者。另选12例年龄和性别配对的健康志愿者为健康对照，为同一时期我院健康体检的人群。

2.诊断标准:A工H的诊断参照1999国际AIH工作组制定的诊断评分标准，激素治疗前评分大于等于15分为AIH,10一15分者为疑似AIH}3}a“缓解”指接受免疫抑制治疗后血清转氨酶、胆红素水平下降至正常水平后至少6个月[}z}0

3.标本采集和保存:所有受试者均清晨抽取空腹外周血2耐于真空采血管中，离心30 min，吸取上层血清标本冻存于一80℃冰箱备用。

4.主要试与仪器:cytometric bead array(CBA)kit(购自美国BD公司)、FACSCalibur flow cytometry 55能们1(购自美国BD公司)，间接免疫荧光试剂盒(购自德国欧蒙医学实验诊断有限公司)、Olympus BX51荧光显微镜(购自日本Olympl‘公司)。

5.趋化因子CCL2,CCLS,CXCL8,CXCL9和CXCL10的检测:试验严格按照CBA试剂盒的说明书操作。

6.自身抗体的检测:间接免疫荧光法检测抗核抗体(antinuclear antibodies,ANA)、抗平滑肌抗体(smooth muscle antibodies,SMA)、抗线粒体抗体(antimitochondrial antibodies,AMA)，选择HEp-2细胞和5种组织(猴肝脏和心肌组织，大鼠肝、I l}R和胃组织)的冰冻切片作为抗原，采用生物薄片马赛克技术将带有细胞和组织的6种切片组合成一个反应区，4℃保存，试验按文献[#]操作。免疫印迹法检测抗可溶性肝抗原/肝胰抗原抗体(anti-soluble liver antigen/anti-Liver pancreas antigen,抗一SLA/LP)，严格按照试剂说明书进行。

7.生物化学指标及特种蛋白的检测:肝功能指标:总胆红素(TB助、碱性磷酸酶(ALP),y一谷氨酞转移酶(GGT);免疫学指标:免疫球蛋白G(IgG),IgA、工gM、补体3(C3)和C4检测按试剂说明书操作。

8.统计学方法:用SPSS16.0统计软件，正态分布的计量资料以均数士标准差(x士s)表示，非正态分布的计量资料以中位数(最小值，最大值)表示。正态分布数据的组间比较采用才检验;非正态分布数据的组间比较采用秩和检验;两组及两组以上计数资料比较，采用Chi-Square检验;相关性分析采用Linear regression回归分析。P<0.05为差异有统计学意义。

结果

研究对象的一般情况:本研究中46例AIH患者，其中25例为活动期患者，男性3例、女性22例，平均年龄(49.24 1 13.91)岁，存在不同程度的肝功能异常、IgG显著升高、自身抗体阳性;21例为激素治疗后缓解期患者，男2例、女19例，平均年龄(49.14士13.21)岁，肝功能恢复正常、IgG轻度升高，但自身抗体仍为阳性，且与活动期比较，自身抗体谱、自身抗体的滴度无明显的差异。

本组患者符合A工H发病特点，经治疗处于缓解期的A工H患者，IgG水平明显下降，但仍略高于正常值，尽管肝功能趋于正常，但依旧处于免疫调节紊乱状态中，见表l

2.A工H患者组及健康对照组血清CCL2,CCLS,CXCLB,CXCL9和CXCL10水平比较:C CL2在AIH组、健康对照组中位数分别为11.79(1.36,114.8)pg/ml,8.39(3.74,13.79)pg/ml，两组比较，差异有统计学意义(Z=一1.958,P<0.05)。CXCL9在AIH组、健康对照组中位数分别为11.31(1.92,364.1)pg/ml,2.69(1.73，7.79)pg/耐，两组差异有统计学意义侈=-4.527,P<0.05)0 CXCL10在A工H组、健康对照组中位数分别15.85(3.8，156.91)pg/ml,4.64(1.04,12.33)pg/ml，两组差异有统计学意义侈_-3.84,P<0.05)0 CCLS,CXCL8水平在A工H患者组、健康对照组间差异无统计学意义沪>0.05)，见图1。提示AIH患者组血清CCL2,CXCL9、和CXCL10水平较健康对照组明显增高。

3.CCL2,CCLS,CXCL8,CXCL9和CXCL10活动期及缓解期A工H患者组血清表达水平比较:活动期组、缓解期组C CL2水平分别为(29.69士28.63)pg/耐、(11.16士10.99)pg/耐，两组差异有统计学意义仕=2.985,P<0.05)。活动期组、缓解期组cxcLB中位数水平分别为7.2(1.79,317.41)pg/ml,5.38(1.68,15.82)pg/ml，两组比较，差异有统计学意义忆=-2.547,P一0.0112)。活动期组、缓解期CXCL9中位数水平分别为16.02(3.09，364.09)pg/ml,5.47(1.92,63.53)pg/ml,两组比较，差异有统计学意义夕=-3.187,P<0.05)o活动期组、缓解期组CXCL10水平分别为(90.01士72.39)pg/ml,(13.24 1 5.77)pg/ml，两组比较，差异有统计学意义(t=2.12,P<0.05)。活动期组、缓解期组间C CL5水平比较，差异无统计学意义沪>0.05)，见图2。提示随着激素治疗病情缓解，A工H患者外周血CCL2}CXCLB,CXCL9和CXCL10水平也明显降低。

4.A工H患者血清趋化因子CXCL8,CXCL9和CXCL10水平与相关临床指标的相关性分析:AIH患者血清CXCL8与同时期肝功能生物化学及特种蛋白指标进行相关性分析，结果提示CXCL8与IgG水平呈正相关关系份z=0.291,P<0.05)，但与血清ALT,AST,TBil}GGT,ALP无明显相关性;CXCL9与ALT,AST水平均呈正相关关系(rz值分别为O.s324,0.33s2,P值均I。而在自身免疫性疾病中，如原发性胆汁性肝硬化患者外周血和肝组织中CXCL9和CXCL10表达水平显著升高，且随疾病进展而升高。

但AIH患者中趋化因子的变化及与临床生物化学指标之间的关系研究甚少。Milks等fsl在急性A工H小鼠模型中发现CXCL9,CXCL10编码基因在mRNA水平表达显著上调，另外，CCL2,CCLS编码基因表达也上调。在本组资料中，我们发现A工H患者血清CCL2,CXCL9和CXCL10水平在活动期明显升高，经过治疗，这些趋化因子于缓解期显著下降接近于健康对照组水平。在研究对象中，有2例A工H患者进行了活动期及缓解期动态随访，并留取了外周血标本，也显示了同样的趋势，但动态随访病例较少，尚需加强对A工H患者的随访观察。

本文中观察到的趋化因子的变化特征与动物模型实验结果能相印证。本研究中缓解期患者均处于接受糖皮质激素治疗的过程中，糖皮质激素有强大的抗炎作用，其主要通过增加或减少基因转录而抑制炎症过程的某些环节，如对细胞因子、炎症介质及一氧化氮合成酶等的影响。故本研究中缓解期AIH患者趋化因子水平下降的原因可能为糖皮质激素的直接抑制作用和其抗炎作用使肝脏炎症反应减弱后通过细胞因子网络调节的间接作用共同所致。总之该结果提示，趋化因子，如CCL2,CXCL9和CXCL10参与A工H的发病机制，并可反映疾病的复发情况。

此外，本研究还发现，AH患者外周血中CXCL9水平与ALT,AST水平呈正相关，r分别为0.5324,0.3352;CXCL10与ALT,AST,GGT水平也呈明显的正相关关系，广分别为0.9551,0.8960,0.8271 o CXCL9与CXCL10均为CXC趋化亚家族的成员，CXCL10可趋化单核细胞、巨噬细胞、T淋巴细胞、自然杀伤细胞和树突状细胞，并可以诱导锰非依赖性过氧化物酶1二(manganese-independent peroxidase,MIP-1二)和MIP-1(3产生。C CL2,MIP-1二和M工P-1日均为CC亚家族趋化因子成员，在炎症反应中产生，可在纳摩尔水平可促进单核细胞、巨噬细胞、树突状细胞和激活的T淋巴细胞募集，是重要的炎症促炎因子[9]。结果提示这些以CXCL9,CXCL10为代表的CXC亚家族趋化因子与以CCL2为代表的CC亚家族趋化因子一起，参与A工H活动期的肝脏炎症活动，可能是A工H疾病进展的重要影响因素之一。

总之，我们的研究结果提示在A工H活动期趋化因子水平明显升高，随着激素治疗病情缓解，趋化因子水平可降至正常水平，其中的CXCL9及CXCL10水平明显与肝脏炎症活动指标呈明显的相关性，提示趋化因子可反映A工H肝脏炎症活动程度，可能是A工H疾病进展的重要因素之一。

参考文献

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