上皮间质转化标志物E-cadherin和Vimentin在原发性肝癌中的表达及其临床意义

肝癌已成为世界第五大最常见肿瘤及第三位肿瘤致相关死亡的病因。尽管肝切除术和肝移植已成为提高肝癌治愈率的主要方式，但由于频繁的肝内及肝外转移和术后的复发，肝癌的五年生存率仅约10%}2-31。肝癌转移、复发是一个多步骤，多环节的连续复杂过程，肿瘤细胞穿透基底膜渗入循环系统是发生转移的重要环节，在这个转移级联反应中，上皮间质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)发挥了关键作用，EMT使肿瘤细胞失去上皮细胞样极性特征，获得间质细胞特征，从而增加了肿瘤细胞的转移和侵袭潜能[4]。EMT促进肿瘤转移通过下调上皮标志物的表达，如E-cadherin,cytokeratins;上调间质标志物表达，如Vimentin,fibronectin,N-cadherin等，其中E-cadherin蛋白表达下调是EMT中最重要的分子事件。

EMT现象在乳腺癌、前列腺癌、结直肠癌等多种肿瘤中已被证实[6j。但EMT标志物在原发性肝癌组织中表达及相互关系，在预测肝癌转移及评估预后方面仍不明确。因此，本研究旨在通过检测EMT标志物E-cadherin和Vimentin在30例原发性肝癌患者肝癌组织及相邻正常组织的蛋白表达水平，分析二者表达相互关系及其与临床病理特征的相关性，同时采用免疫组织化学检测EMT转录因子Twist和E-cadherin,Vimentin在肝癌组织及邻近正常组织的表达，进一步判定它们在预测转移和评估预后方面的作用。

资料与方法

1.临床标本收集:该研究经第三军医大学第二附属医院伦理委员会审核通过，标本收集取得患者本人及家属同意。收集本院肝胆外科2011年11月至2012年10月期间，共30例原发性肝癌患者肝癌组织标本及相邻正常组织标本，所有标本均经病理学检查证实。

2.主要试剂和仪器:E-cadherin鼠抗人单克隆抗体、Twist兔抗人单克隆抗体购自英国Abcam公司，Vimentin兔抗人多克隆抗体购自美国Santa C ruz公司，一肌动蛋白((3-actin)鼠抗人单克隆抗体购自美国Sigma公司，荧光染料标记的680驴抗兔第二抗体、荧光染料标记的780羊抗鼠第二抗体购自美国LI-COR公司。免疫组织化学试剂盒、二氨基联苯胺(DAB)显色试剂盒购自北京中杉金桥生物技术有限公司。醋酸纤维素膜、Power pac电泳仪购自美国Bio-Rad公司。Odyssey双色红外激光成像系统购自美国LI-COR公司。LEICA DM6000 B显微镜购自德国Leica公司。

3.Western blot:采用8%的十二烷基硫酸钠-聚丙烯酸胺凝胶电泳(SDS-PAGE)检测E-cadherin,10%的SDS-PAGE检测Vimentin;均采用湿转，E-cadherin转膜150 mA,2 h;Vimentir.转膜150 mA,90 min;封闭液(含5%脱脂奶粉的PBS)封闭醋酸纤维素膜1h;分别加E-cadherin第一抗体，Vimentir{第一抗体，4℃摇床孵育过夜，E-cadherin孵育荧光染料标记的780羊抗鼠第二抗体，室温1 h,Vimentin孵育荧光染料标记的680驴抗兔第二抗体，室温1h;两张膜孵育价actin鼠抗人第一抗体，室温1h，接着孵育荧光染料标记的780羊抗鼠第二抗体，第一、二抗体孵育完成后均用1 X TBST洗涤醋酸纤维素膜3次，10 min/次。采用Odyssey双色红外激光成像系统对醋酸纤维素膜进行扫描，利用LI-COR公司提供的Odyssey 2.0软件分析显色结果，目的蛋白的荧光强度值视为目的蛋白表达量，a-actin荧光强度值视为内参照蛋白表达量，将目的蛋白表达量与内参照蛋白表达量的比值作为目的蛋白表达的相对量，用于后续的相关分析。

4.免疫组织化学染色:手术切除标本离体后均立即取材，经4%多聚甲醛固定，常规石蜡包埋，制成5}m厚的连续切片，用于检测Twist,E-cadherin和Vimentin的蛋白表达。E-cadherin,Vimentin,Twist抗体工作液浓度分别为1:50,1:100,1:500。采用免疫组织化学SP法进行染色，主要步骤如下:放置组织切片于烤箱，68℃20 min;常规二甲苯脱蜡，梯度乙醇脱水;采用0.01 mmol/L拘椽酸缓冲液高温抗原热修复15 min，冷却至室温;3%H202 37℃孵育20 min以阻断灭活内源性过氧化物酶;正常羊血清工作液封闭30 min;依次滴加第一抗体4℃过夜，滴加生物素标记第二抗体37℃孵育20 min;滴加辣根过氧化物酶标记的链霉素卵白素工作液37℃孵育30 min;DAB显色，苏木素复染，常规脱水、透明、干燥，封片。

5.统计学方法:所有数据采用SPSS13.0软件进行统计分析。E-cadherin,Vimentin在30例患者肝癌组织与相邻正常组织的表达差异采用配对才检验分析，比较E-cadherin,Vimentin在肝癌组织中表达量与门静脉癌栓，TNM分期，病理分级，Milan标准等两组间的比较时采用Mann-Whitney U检验，比较Vimentin在肝癌中表达与E-cadherin表达，肿瘤大小，甲胎蛋白值，病因等相关性时，采用spearman等级相关分析。数据采用均数士标准差}x士s)表示，以尸<0.05表示差异有统计学意义。

结果

1.一般情况:30例肝癌患者临床资料如表t

2.E-cadherin在肝癌组织及相邻正常组织的表达:E-cadherin在肝癌组织表达荧光强度值为0.082士0.063，较相邻正常组织相对表达量0.226}0.215显著降低(图1，图2A),差异具有统计学意义，t=-4.050,P<O.Olo E-cadherin在门静脉癌栓形成患者肝癌组织中相对表达量为0.042士0.032，较未形成门静脉癌栓患者癌组织中相对表达量0.116士0.063明显降低(图2B)，差异有统计学意义(U=34.0,P=0.001);E-cadhe二在TNM III期患者肝癌组织相对表达量0.048士0.034较TNM工/B期患者癌组织中相对表达量0.121士0.067明显降低(图2C)，差异有统计学意义(U=41.0,P=0.003);E-cadherin在Edmondson Steiner grade病理分级IB/IV患者癌组织中相对表达量0.075 1 0.056,与工/B级患者癌组中相对表达量0.091士0.074比较(图2D)，差异无统计学意义(U=99.0,P-0.719)。

3.Vimentin在肝癌组织、相邻正常组织表达及与E-cadherin表达相关性:Vimentv〕在肝癌组织相对表达量为0.638士0.397，较相邻正常组织相对表达量0.398士0.282增高(图3)，差异具有统计学意义(t=3.393,P=0.002)o Vimentin在肝癌组织中的表达与E-cadherin在肝癌组织中的表达呈负相关份一一0.509,P=0.004)o Vimentin在门静脉癌栓形成患者肝癌组织中相对表达量为0.913士0.363，较无门静脉癌栓患者癌组织相对表达量0.397士0.239显著增高(U=24.O,P<0.01)。Vimentir{在TNM III期患者癌组织相对表达量为0.870士0.359，较TNM工/II期患者相对表达量0.372土0.245显著增高(U=25.0,P<0.01)。Vimentin在符合Milan标准患者中的相对表达量为0.295士0.177，较超过Milan标准的患者中相对表达量0.742士0.387降低(U=23.0,P=0.005)0 Vimentin在肝癌组织中的表达量与患者年龄、性别、病因、血清AFP水平、肝功能分级、肿瘤病理分级相比较，差异无统计学意义(表2)

4.免疫组织化学检测E-cadherin,Vimentin,Twist在肝癌及相邻正常组织表达:镜下观察可见E-cadherin在肝癌组织中几乎不表达(图4A)，而相邻正常组织中呈高表达，其表达主要定位于细胞膜，呈红棕色颗粒围绕细胞(图4D)，这与该分子起细胞间连接作用的功能相一致;Vimentin在肝癌组织中呈高表达，主要位于细胞质内，呈棕黄色颗粒(图4B)，在相邻正常组织中不表达(图4E);Twist在肝癌组织中高表达，主要位于细胞核和细胞质内，呈深棕色颗粒(图4C)，而在相邻正常组织内不表达(图4F)。

讨论

EMT在胚胎发育、器官形成及肿瘤发生与发展过程中具有重要的作用.EMT发生时，上皮细胞失去极性，重塑细胞骨架，细胞由上皮样结构转变为成纤维样或间质样表型，增加了其运动能力，使其获得较强的转移能力。肿瘤转移是一系列分子事件序贯发生的过程，包括癌细胞侵犯基底膜、局部侵袭、内渗人血管、形成循环肿瘤细胞、抵抗机体免疫并随血循环到达全身各处、外渗至远处器官，增殖并形成转移灶[9]。越来越多证据表明EMT在多种肿瘤转移过程中发挥关键作用，主要通过降低上皮标志物表达，增加间质标志物表达，使得细胞载附能力降低而增加细胞运动能力，从而增加了细胞的转移侵袭能力[uo]E-cadhe二是细胞勃附分子钙载蛋白家族中重要成员，其在维持细胞间戮附性、细胞极性及细胞间信息传递方面发挥重要作用。其表达降低或缺失是EM7，最显著的特征，同时也是多种肿瘤不良预后及转移的临床预后指标[12-13]。本研究结果显示，E-cadherin在原发性肝癌患者癌组织中表达量较正常组织表达显著降低沪<0.01);表明肝癌发展过程促进了EMT的发生。同时分析发现E-cadherin在门静脉癌栓形成患者癌组织中表达量较未形成门静脉癌栓患者癌组织中表达明显降低，说明E-cadherin的降低与门静脉癌栓形成密切相关，这由于E-cadherin表达量降低使得肝癌细胞间孰附能力下降，易于从原发灶脱落，侵袭门静脉分支而形成癌栓。另外，在TNM III期患者癌组织中E-cadherin的表达较TNM工/II期明显降低，说明随着肝癌疾病进程不断发展，EM"l，发生愈加明显，因此可以推断E-cadhe二的表达降低可为预测肝癌的临床预后提供一定的指导作用。E-cadherin在不同病理分级的肝癌患者癌组织中表达差异无统计学意义沪=0.719),表明E-cadherin蛋白表达变化与癌细胞分化程度无明显相关性。Vimentin作为中间丝蛋白家族的主要成员，几乎表达于所有正常的间质细胞中，对维持细胞完整性和抵御外界应急的损伤起了重要的作用。

如今，Vimentin作为标准的EMT标志物fa,gal已达成广泛的共识。该研究结果显示，Vimentin在肝癌患者癌组织中表达较相邻正常组织表达显著增高(P=0.002)，这与目前报道Vimentin在多种肿瘤表达明显增高相一致，如前列腺癌，乳腺癌，结直肠癌等[15]本研究结果显示，Vimentir{蛋白与E-cadherin蛋白在肝癌组织中的表达呈负相关行_-0.509,P=0.004)，同时Vimentin蛋白表达在门静脉癌栓形成患者癌组织中表达较未形成癌栓者显著增高，这表明Viementin增加了癌细胞迁移、侵袭能力通过降低E-cadherin的表达实现的，与肝癌转移发生密切相关，这也同McInroy和Maatt澎m〕提出的下调Vimentin的表达抑制了细胞的迁移和薪附能力的观点相一致。Twist是位于细胞核的转录因子，在EMT过程中通过抑制E-cadherin的表达，上调间质标志物N-cadherin的表达从而增加细胞的迁移和侵袭能力，在多种上皮来源肿瘤中表达升高且与肿瘤的转移呈明显的正相关。

该研究结果显示厂Cwist蛋白在肝癌组织表达增高，而相邻正常组织不表达，由此可以推断，Twist在肝癌发展过程中，通过抑制E-cadherin的表达而介导EMT的发生，从而促进肝癌的侵袭和转移，这也可能成为肝癌潜在的分子治疗的靶点，这一假设有待对Twist在肝癌EM"l，中发挥作用的分子机制进行研究。总之，本研究结果提示，EMT标志物E-cadherin,Vimenti!与肝癌转移发生密切相关，对肝癌临床预后的判断有一定的指示作用，可作为评估肝癌转移复发及临床预后的有效分子指标。同时，深人研究肝癌EM7，发生机制、调控因素将对指导肝癌的分子治疗提供更为重要的实验依据。

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