杀伤细胞免疫球蛋白样受体基因多态性对造血干细胞移植后巨细胞病毒感染的影响

动物模型研究证实CMV感染后NK细胞的激活性受体1科9H和抑制性受体1科9I能与主要组织相容性复合物(MHC)I的类似物结合，调控NK细胞对CMV的杀伤或逃逸}1_2}。人类NK细胞没有1y49 H和1科9I受体，但人类的杀伤细胞免疫球蛋白样受体(killer cell immunoglobulin like receptor,KIR)与鼠的1y49 H和1y49I受体结构类似，属于免疫球蛋白样超家族的一系列分子，表达在NK细胞和部分T细胞的表面。它们可与靶细胞表面的MHC I类分子结合，传导激活或抑制信号，从而调节NK细胞和T细胞的活性. KIR也包括抑制性(iKIRs)和激活性受体(aKIRs)。人类KIR基因存在丰富的多态性，目前发现的主要有14种KIR基因表达，2种单体型。KIR基因多态性与造血干细胞移植后CMV感染致病的相关性尚不清楚，本研究探讨了KIR基因的多态性在造血干细胞移植后CMV感染中的作用。

对象和方法

1.研究对象:选择2005年10月至2011年5月在苏州大学附属第一医院行造血干细胞移植患者138例，其中男86例，女52例，中位年龄27(11-58)岁。无关供体造血干细胞移植56例，同胞全相合造血干细胞移植67例，单倍体造血干细胞移植15例;其中人类白细胞抗原(HLA)全相合移植109例，HLA不相合移植29例。患者原发病包括急性髓性白血病(AML)s 1例，急性淋巴细胞白血病(ALL)32例，慢性粒细胞白血病(CML)28例，重型再生障碍性贫血(SAA)8例，慢性粒单核细胞自血病(CMML)1例，杂合性白血病(HAL)6例，骨髓增生异常综合征(MDS)12例。髓性白血病及部分低危组的ALL以改良的马法兰/环磷酞胺(Bu/Cy)方案进行预处理;淋巴系统和合并中枢神经系统白血病的髓性白血病以全身照射(TBl)+Cy为主的预处理方案;移植物抗宿主病(GVHD)的预防方案:甲氨蝶吟(MTX)移植后第1天(dl)is m剔m2,d3,d6,d11 10 m扩mzm;长程环抱素A(CsA)3 mg·kg一’·<1一‘移植前第10天(一10 d)起;无关供体移植或脐带血移植加用抗胸腺细胞球蛋白(ATG)2.s mg kg一‘·d一’，一sd~一2 d;霉酚酸醋(MMF)is mg·k}一’·12h一工，一7d起。

2.标本收集:移植前收集4 ml供受体外周血用于KIR基因检查，移植后每周收集1次受体外周血用于检查CMVpp65 0 

3.KIR基因分型方法:采用序列特异性引物聚合酶链反应(PCR-SSP)基因分型。扩增条件为:95 0C预变性5 min,95℃变性30 s,680C退火30 s,72℃延伸90 s,30个循环。KIR单体型分型:(1)A单体型:以iKIR为主，惟一的aKIR为KIR2DS4，其可进一步分为2DS4*001-002和2DS4*003-007，两者可同时存在;(2)B单体型:包含多种aKIR(KIR2DSI,KIR2DS2、KIR2DS3、KIR2DS5、KIR3DSl)的不同组合。如果B单体型同时存在KIR2 DS4，称为AB单体型。

4.CMV感染和CMV病的诊断:CMV感染是指在体液或组织中检测到CMV包涵体或CMV抗原血症、DNA血症阳性但不伴有临床症状或影像学征象。CMV病是指存在CMV感染的证据同时伴有框应的临床症状或影像学征象一5〕。

5.CMV感染干预性治疗方案:所有移植患者在一lOd开始用更昔洛韦5 mg·kg.预防.直到一2d。移植后2周，造血重建后开始每周1次CMVpp65检测，一旦发现其中任何一项阳性启用更昔洛韦10 mg·kg，直到以上指标转阴，减半继续治疗1周后停用以上药物。如果CMV抗原持续阳性，则改用嶙甲酸钠180 mg}kg-'·d-'0

6.统计学处理:KIR基因表型频率(PF)=表型数/总数;单倍型频率f'(%)=单倍型阳性率n/2 N,N为研究个体人数，其他数据采用SAS 8.02统计软件处理，率的比较采用卡方检验，多因素分析用logistic回归模型。

结果

1.KIR基因型结果:供受体KIR各基因频率见表1，供受体KIR基因频率分布无明显差异，iKIR 2DL1,2 DL3,2DL4,3 DL1,3 DL2,3 DL3出现频率均在90%以上，为常见的iKIR基因型。aKIR基因2DS4出现频率最高，而其次为2DS1,2DS5和3 DSl，最低为2DS2和2DS3。出现频率最高的aKIR 2DS4基因可以分为3个亚型分别为2DS4}001-002,2DS4*001-007和2DS4*003-007，三者分布比例为58.40%}28.80%和12.80%}2DS4}001=002为最常见亚型，而2 DS4}003-007较为少见。

2.KIR单体型检测结果:供体KIR单体型分布:AA单体型73例，频率为52.90%;BB单体型19例，频率为13.77%;AB单体型46例，频率为33.33%。受体KIR单体型分布:AA单体型67例，频率为48.55%;BB单体型13例，频率为9.42%;AB单体型58例，频率为42.03%。

3.供受体KIR基因型与CMV感染:CMV阳性组和阴性组供受体KIR各基因频率见表2。供体2DS2,2DS4 Y 003-007基因在CMV阳性组频率明显低于CMV阴性组，差异有统计学意义，受体KIR基因CMV阳性组和阴性组之间差异无统计学意义。

4.供受体KIR单体型与CMV感染:供体为AA单体型的CMV感染率为64.38%,BB单体型的为36.84%,AB单体型的为50.00%。受体为AA单体型的CMV感染率为53.73%,BB单体型的为46.15%,AB单体型的为51.72%。供体BB单体型CMV感染率明显低于AA单体型的(P=0.0299)o 

5.CMV感染危险因素的多因素分析:将受体年龄(蕊40岁，>40岁)、受体性别、供者性别、血型是否相合、HLA,GVHD,ATG应用、疾病状态、供体2 DS2基因、供体2DS4 x 003-007基因、供体AA单体型、供体BB单体型候选变量引人多因素logistic回归模型，采用逐步回归方法筛选出独立危险因素(a人=0.10,崛=0.巧)。HLA不相合、度GVHD,ATG应用是CMV感染的危险因素，供体存在2DS4-}003-007基因、供体BB单体型是降低讨论造血干细胞移植早期以NK细胞重建为主，T细胞重建较晚;而CMV激活时间是在移植后的第35}60天，因此移植早期CMV激活与NK细胞功能密切相关。NK细胞固有的免疫系统是通过NK细胞表面受体KIR和MHC及aKIR和iKIR的平衡来调节的0。KIR位于染色体19p13.4，含有2个KIR2 D或3个KIR3 D结构域。KIR形态上可分为介导抑制信号的长(L)细胞浆内尾端(KIR2 DL和KIR3 DL)和介导活化信号的短(S)细胞浆内尾端(KIR2DS和KIR3 DS。

当抑制型受体与HLA配体结合而无活化型受体一配体相互作用时，因抑制信号网的启动而不产生细胞溶解。相反，当活化型受体与靶细胞表面的相应配体结合同时无抑制型受体-配体的相互作用时，形成活化信号网络，导致靶细胞溶解。正常组织中抑制型受体一配体相互作用显著强于活化信号，故而产生抑制信号网，或者既无活化又无抑制信号，故而不发生NK细胞所致的靶细胞溶解。最近对于KIR的研究主要集中在移植早期GV HD和移植物抗白血病(GVL)效应中KIR的作用，NIC细胞作为重要的抗感染细胞，KIR是主要的受体，在鼠的CMV模式中发挥了重要作用，但是KIR基因与感染的关系研究却非常少。近年来KIR在CMV感染中的作用逐步被大家认识，2006年Chen等首次报道。KIR基因影啊造血干细胞移植后CMV感染的发生，2006年Cool、等报道在非去T细胞的同胞供体移植中供体为A单体型的CMV激活率高，而供体为B单体型的受体CMV激活率低。2009年Zaia等报道存在一个或多个aKIR是影响造血干细胞移植后CMV激活的关键基因。在本研究中，138对供受体KIR基因的分布频率没有差异，2DL1,2DL3,2DL4,3 DL1,3 DL2,3 DL3是常见的iKIR,2DS4是最常见的aKIR。我们发现供体为2DS2和2DS4}003-007基因的移植患者中，CMV感染发生率明显降低，差异有统计学意义。供受体KIR基因的单体型分布频率没有差异，在供体为AA单体型的移植患者中CMV感染率明显高于供体为BB单体型移植者，这与国外的报道基本一致，其原因可能是BB单体型移植患者存在多个aKIR，激活性信号强于抑制性信号，NK细胞发挥更大的清除病毒的作用[1"}0 2DS4基因作为A单体型惟一存在的aKIR基因型，其功能一直在探索中，它的3个亚型2DS4*001-002,2 DS4 x 001-007,2DS4-}003-007分别代表完整型基因、缺失完整型基因、缺失型基因,2DS4*003-007是缺失表达的KIR基因型，为什么aKIR的缺失表达还能导致CMV感染增加呢?在供体为2DS4}:003-007基因型的造血干细胞移植中，有研究证实其GVRD发生率较供体为2DS4}001-002基因型的低，其原因是2 DS4}001-002基因导致aKIR的过度表达，从而导致异源性NK细胞过度活化，组织也过度损伤，因此供体为2DS4}001-002基因的度GVHD发生率明显增加。同时也有人认为aI}IR的表达过度同时也可以导致iKIR的表达过度，NK细胞的某些功能受到抑制，杀伤病毒能力下降m0'9}0 2DS4 003-007基因虽然是缺失表达激活性的KIR，但是它能够在血浆中以蛋白形式存在，该蛋自的存在是否可以诱导NK细胞的抗感染功能，这有待于进一步研究。

由于CMV疾病的病例太少，我们没有对I}IR基因多态性与CMV疾病的相关性进行研究，多因素的回归分析结果显示供体BB单体型的移植以及供体为2 DS4-}003-007基因型确实是降低CMV感染的保护因素，同时我们也证实GV HD,HLA不相合以及ATG的应用是CMV感染的高危因素，这与之前报道基本一致。供体KIR基因的多态性影响了造血干细胞移植后CMV感染的发生，这为我们移植供体的选择和制定预防CMV感染的方案提供了很好的参考价值。

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