siRNA沉默PELP1基因对结肠癌Lovo恶性生物学行为影响的实验研究

肿瘤的发生是原癌基因激活、抑癌基因失活的过程。研究表明，从正常结肠上皮、结肠腺瘤到结肠癌，雌激素受体共调节因子—脯氨酸，谷氨酸，亮氨酸富集蛋白1(Proline,-glutamic acid,-leucine rich protein 1,PELPl)的表达逐渐升高。本研究利用:iRNA干扰结肠癌Lovo中PELP1的表达，观察rIL默前后结肠癌Lovo恶性生物学行为的变化，探讨PELP1在结肠癌发生中的作用。

1材料和方法

1.1细胞来源和主要试剂结肠癌细胞株Lovo购自武汉大学中国典型培养物典藏中心。RPMI1640培养基和胎牛血清(FBS)、双抗购买自Hyclone公司，MTT购买自Gibc。公司，Transwell板购买自Corning公司，Matri胶为Sigma公司产品，siR1VA由上海吉玛制药技术有限公司合成，Lipofectamine 2000购买自Invitrogen公司，PELP1一抗购自Santa Cruz，二抗购自武汉博士德公司其他试剂为分析纯。

1.2细胞培养使用RPMI1640+10%FBS+100 LL青霉素++100 p,g链霉素在370C,5%C0-、饱和湿度的环境里对结肠癌L ovo细胞株进行培养，待细胞密度达7001080%时予以传代。

1.3转染及实验分组将2 0 N.,mo比的siRNA 8-.-.,工稀释于250 p,L无dI1.清DMEM，轻轻混匀，室温孵育5 min Lipofectamine2000使用前轻轻摇匀，然后取出8与250无血清RPMI1640混匀，室温孵育5 min。将siRN_4稀释液与Lipofectamine2000稀释液混匀，总体积500-,L，室温孵育20 min。转染前1d将细胞接种于6孔培养板，接种密度为1 x1 OJ/孔，使得次日转染时细胞融合达60%-70%.

实验分为对照组、空白载体组、siRNA组和siRNA-PELPl组，每组3个复孔，每个实验均重复3次。转染前更换培养基，每孔内完全培养基体积为1 mL。分别加人PB S,Lipofectamine2000,siRNA,siRNA-PELP1复合物，前后左右混匀。用完全培养基调整每孔溶液终体积至2 mL,siRNA的终浓度为0.08 N.,mol/L培养2072 h

1.4 PELP1基因检测使用RT-PCR检测转染前后PELPl基因的表达。实验步骤按试剂盒说明操作，使用Trizol一步法提取RNA，人PELP I基因的引物序列为:正向引物5'CCCGTAAACTGGGCTTCA-CA3'，反向引物5'GCTCAGAAGGTCGATCCTGG3',产物大小为185 bp.

1.5 PELP1蛋白检测使用Western-blot检测转染前后PELPl蛋白表达的变化使用RIPA裂解液抽提总蛋白,10%SDS-PAGE分离蛋白，转PVDF膜，一抗(稀释浓度为1:200)4℃过夜，二抗370C,0.5 h,ECL发光液显影，将图片扫描后应用Gel Doc 2000 Gel Documentation System(Bio-Rad公司)成像，通过Quantity On。成像分析软件进行半定量分析。强度以吸光度(OD)来表.

1.6 MTT法检测转染前后Lov。增殖能力的变化将对照组和siRNA-PELP1组以每孔200个细胞接种在96孔板上，各3个复孔，培养48 h后，连续观察7 d,MTT法检测每孔OD值，绘制生长曲线。

1.7软琼脂克隆形成实验检测转染前后Lo、克隆形成能力的变化制备底层琼脂和上层琼脂后，将对照组和siRNA-PELP1转染组以每孔300个细胞接种在六孔板上，各3个复孔，进行常规培养，待培养至2周时终止培养，把培养板放置在倒置显微镜上，镜下计数直径大于75 N.,m或含50个细胞以上的克隆为阳性克隆。克隆形成率(%)二阳性克隆数/种板细胞数x 100%

1.8 Transwell小室检测迁移和侵袭能力的变化迁移实验:将培养至对数生长期的对照组和、iRNA-PELP 1转染组Lov。细胞消化，计数，调整细胞密度为2x 1 OS/mL，在下室加人600800 p,L含10%血清的培养基，上室加人100150 p,L细胞悬液，继续在孵箱培养24 h,Giemsa染液染色后，取出下膜，中性树胶封片，显微镜下取9个随机视野计数，统计结果。侵袭实验:在Transwell小室上室内加人100p,L 1 mg/mL的Matrigel,37℃温育4-5 h，余下步骤同迁移实验。

1.9统计学处理应用Graphpad Prism 5.0软件进行统计一学分析并作图。计量资料以-1、来表示，所有数据来自3个独立的实验。使用配对t检验分析两群细胞之间的差异。P-0.05认为差异有统计学意义

2结果

2.1各组PELP1 mRNA和蛋白质的表达变化*iR-NA-PELP1组Lovo中的PELP1 mRNA和蛋白质的表达均下降，沉默效率达80%(图1一2).

2.2转染siRNA前后Lov。增殖能力的变化转染siRNA后Lovo的增殖能力降低，见图3.

2.3转染siRNA前后Lovo克隆形成能力的变化转siRNA后Lov。的克隆形成能力下降见图4

2.4化转染siRN.4前后T24迁移和侵袭能力的变转染siRNA后T24的迁移和侵袭能力下降，见图5-6

3讨论

PELP1是近来发现的雌激素受体激活物，也称作雌激素受体非基因组效应的调节物(M NAR);结构包括几个保守的蛋白与蛋白相互作用的基序，介导了PELP 1与许多蛋白的相互作用，包括雌激素受体、转录因子、细胞周期调节因子、生长因子受体和激酶，允许与各种细胞内信号通路相互作用。PELPl还介导了雌激素受体的基因组和非基因组效应.

近来的研究表明，PELPI在几种性激素反应性肿瘤中表达失调，包括乳腺癌s、子宫内膜癌6es、卵巢癌u、前列腺癌。在卵巢癌细胞株OVCAR3中PELP 1下调可以降低肿瘤的增殖能力和在裸鼠体内成瘤的能力，并影响c-Src和AKT通路的大部分信号蛋白。Rajhans等证实PELPI是一个癌基因，在成纤维细胞和上皮模-u细胞中过表达可以导致细胞的转化。在聚焦形成测定‘focus for-mation assay)中，他们发现PELP 1增加了c-Src激酶的转化潜能，其过表达能够增强雌二醇介导的细胞迁移潜能和锚着非依赖性生长。与转染空载体的细胞相比，稳定过表达PELP1的乳腺癌细胞在异种移植研究中表现出较迅速的生长;免疫组化分析提T-PELP1较多表达在高侵袭性乳腺癌中。结肠癌虽然不是激索依赖性肿瘤，但是越来越多的证据表明其与雌激素受体，尤其是雌激素受体俘的表达失调有关I I1早在上个世纪80年代，McMiehael和Potter等通过研究西方国家妇女结肠癌的发病率和死亡率之后提出假说:使用外源性的雌激素可降低妇女结肠癌的发病率，提示雌激素及雌激素受体在结肠癌的发病中起一定的作用，但是具体起促进作用还是抑制作用日前还有争议。Tu等利用腺病毒载体将雌激素受体日转进结肠癌HCT-116细胞，发现减少了HCT-116细胞的迁移，增加了侵袭。张涛等发现雌激素受体俘是小鼠结肠腺癌细胞系MCA-38所表达的主要雌激素受体，一定浓度的雌二醇对MCA-38有明显的促增殖作用。Grivas等IS发现，与正常豁膜相比，雌激素受体日和PELP1在结肠癌中表达增高本研究使用siRNA沉默结肠癌Lovo中的PELP1基因，发现结肠癌Lov。的增殖能力、克隆形成能力、迁移和侵袭能力随之降低，提示PELP1在结肠癌Lovo中起癌基因的角色，但发生机制尚需进一步研究。

参考文献

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