茉莉酸甲酯诱导人肝癌细胞HepG2细胞凋亡过程中端粒酶活性变化

茉莉酸甲醋(methyl jasmonate,MeJA)是一种新型植物激素，对HepG2细胞增殖具有明显的抑制作用，同时通过影响凋亡相关基因的表达变化，诱导肝癌细胞发生凋亡[1-3]。端粒酶的异常活化是癌细胞无限增殖的关键，本研究旨在探讨在茉莉酸甲醋诱导HepG2细胞凋亡过程中端粒酶活性变化，深人阐述茉莉酸甲醋对人肝癌细胞HepG2诱导凋亡作用的分子机制。

1材料和方法

1.1材料人肝癌细胞株HepG2购自中国科学院上海生物研究所。茉莉酸甲酷及全反式维甲酸(all-trans-retinoic acid,ATRA)购自Sigma公司二引物序列采用Primer Primer5.0软件进行设计:hTERT 5'-CCTGCCGTCTTCACTTCC-3'，5‘-TGAAC AATGGC-GAATCTGG-3'RT-PCR试剂盒购自Qiagen Ger-many公司。兔抗人端粒酶蛋白免疫组化多克隆抗体购自福州迈新生物技术开发有限公司。

1.2方法

1.2.1细胞培养将HepG2细胞培养于含10%胎牛血清RMPI-1640的完全培养基中，370C,5%CO},95%空气的培养箱中培养生长。

1.2.2实验分组对照组:仅加人含DMSO终浓度为0.01)的RPMI-1640完全细胞培养液。MeJ A组:加入含有终浓度为MeJ.}工作浓度的RPVI卜1640完全细胞培养液。ATRA组:加人含有终浓度为10 p.,mol/L ATRA的RPMI-1640完全细胞培养液。MeJA+ATRA组:加人含有终浓度为MeJA工作浓度的MeJA和10}..},mol/L ATRA的RPMI-1640完全细胞培养液二于实验分组48 h后，检测各项指标。

1.2.3在Gel Doc(Bio-Rad)凝胶成像分析系统上扫描定量测定读取各带的吸光度值(OD)。以(3-actin为内参，根据各条带的OD值分析hTE RT的mRNA表达水平。以卜actin为内参照，结果以目的基因条带OD/日-actin条带OD表T 0 mRNA相对表达量=目的基因条带OD/日-actin条带.

1.2.4免疫细胞化学SP检测HepG2细胞端粒酶蛋自表达每组分别选取5张切片，每张切片均在高倍镜(x400)视野下随机取8个视野，一记数细胞总数和阳性细胞数.计算百分率.取其均数。

1.3统计学处理采用SPSS 13.0统计软件包进行统计分析，组间比较采用单因素方差分析和仔检验，计量资料采用t检验，等级资料采用秩和检验，结果用x1、表示，P<0.05为差异具有统计学意义

2结果

2.1 MeJ=}对HepG2细胞内hTERT mRNA表达的影响hTERTmRNA琼脂糖凝胶电泳结果显T:与对照组相比，MeJA组、ATRA组及MeJA+ATRA组作用HepG2细胞48 h后，各组hTERT mRNA表达水平均明显下降(P<0.05)o MeJA组、MeJA+ATRA组与ATRA组相比，差异均具有统计学意义(P<0.05),见表1，图1

2.2 MeJA}t HepG2细胞内端粒酶蛋白表达的影响端粒酶蛋白免疫细胞化学检测结果表明:对照组HepG2细胞端粒酶蛋白表达较高，经MeJ A组及MeJA+ATRA组作用HepG2细胞48 h后，端粒酶蛋白表达水平均显著降低(P<0.01);ATRA组与对照组比较，端粒酶蛋白表达存在差异(P<0.05);与Me-JA组相比较，ATRA组及MeJA+ATRA组端粒酶蛋白表达差异显著(P<0.01);ATRA组与MeJA+ATRA组之间比较，端粒酶蛋白表达差异显著(P<0.01)。见表2，图20

3讨论

端粒酶(telomerase)是一种特殊的逆转录酶，其存在使染色体的端粒得以复制，增加染色体稳定性。端粒、端粒酶与肿瘤的相关性受到普遍关注。端粒酶是区别正常细胞和肿瘤细胞的一个显著特征，在85%以上的肿瘤细胞表达，而在造血于细胞和生殖细胞以外的正常细胞为阴性气因此端粒酶的活性表达可以用于肿瘤诊断、治疗及判断预后的指标。在体细胞中，端粒酶和端粒酶逆转录酶(hTERT)活性水平随着细胞分化而降低，而成年组织中分化细胞不具有端粒酶活性，也不表达或表达微量hTERT。端粒酶活性的调节具有细胞周期依赖性，肿瘤细胞在静止期端粒酶活性被抑制，而在分裂期的G，期、S期、叹/M期不同时相中端粒酶活性升高R-.Hsieh等研究发现，肝癌中由于细胞周期素D1和周期素依赖性激酶等调控蛋白的异常表达导致细胞周期失调，可激活端粒酶，而致活性增高。端粒酶的异常活化是癌细胞无限增殖的关键。人端粒酶催化亚单位hTERT是端粒酶活性的必需和限速成分，抑制hTERT表达可降低端粒酶的活性，导致肿瘤细胞的凋亡和衰老，这可能是MeJA具有抗肝癌细胞作用的机制之一。目前研究最为广泛的维甲类(retinoids)药物一一全反式维甲酸(ATRA)经实验证明，对包括肝癌在内的多种恶性肿瘤，具有抑制肿瘤细胞增殖、诱导肿瘤细胞分化和凋亡等作用。然而，维甲酸类药物用于肿瘤的治疗尚存在许多明显的不能被忽视的毒副作用，从而影响肿瘤的治疗效果，如维甲酸治疗后存在停药后易复发反弹、骨髓抑制。茉莉酸甲酷(MeJA)是一种新型植物激素，对HepG2细胞增殖具有明显的抑制作用，能够显著地诱导肝癌细胞凋亡。茉莉酸甲醋通过降低抑凋亡相关基因Bcl-2 mRNA及蛋白的表达，上调促凋亡相关基因BaxmRNA及蛋白的表达，同时通过下调mtp53及其蛋白的表达，相对增加了wtp53的比例，引起细胞凋亡。本实验结果表明，MeJA通过下调hTERTm-RNA及端粒酶蛋白的表达，可降低端粒酶的活性，导致肿瘤细胞的凋亡，从而发挥抗肝癌作用。

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