PARP-1抑制剂作为131I辅增敏剂在甲状腺癌治疗中的应用

甲状腺癌是内分泌系统最常见的恶性肿瘤，也是近十年来女性恶性肿瘤中发病率上升速度最快的恶性肿瘤。在过去的十年中，女性发病率从2000年的第9位突增到2010年的第5位，平均年增长率达6.2%。目前放射性碘治疗成为甲状腺癌患者手术后辅助的主要方法，大规模回顾性分析数据显示，约40%的甲状腺癌患者在接受手术治疗后都需要进一步接受isil治疗。然而部分患者对Lsil治疗不敏感或敏感性下降。聚腺营二磷酸核糖转移酶-1(poly ADP-ribose poly"merase-1,PARP-1)，是存在于真核细胞中催化聚ADP核糖化的细胞核酶，它参与的聚ADP核糖化是真核细胞中蛋白质翻译后的重要修饰方式之一。本研究旨在探讨在131I损伤癌细胞DNA的同时加用PARP-1抑制剂(PJ-34)是否能够增强131I内照射治疗的效果

1材料和方法

1.1实验材料甲状腺癌细胞株BCPAP由华中科技大学附属协和医院普外科实验室提供。RPMI-1640培养基、DMEM/F12(l:1)培养基购自美国Hy_clone公司，胎牛血清购自美国Gibc。公司，胰岛素购自美国Sigma公司，PJ-34购于美国Inotek Phau-maceutical公司，131I取自武汉协和医院核医学科，CCK一购自上海碧云天生物技术有限公司，Anex-inV-FITC凋亡试剂盒购于南京凯基生物有限公司，Bcl-2,Bax抗体购于武汉博士德生物工程有限公司。

1.2实验方法

1.2.1细胞培养采用含10%胎牛血清的RPMI-1640培养基在370C,5%CO:的细胞培养箱中培养BCPAP细胞，每3d换1次液，待细胞铺满瓶底超过80%后以0.25%胰酶消化并按1:3比例传代。

1.2.2 CCK-8检测药物对细胞的抑制率实验分3组，即riI处理组、PJ-34处理组、131I与PJ-34共同处理组。每组内又分3个亚组，即空白组、对照组和药物处理组，其中，空白组内仅含100},L完全培养基，对照组中含有100,L完全培养基和3 000个BCP 1P细胞，处理组对100},L完全培养基中3 000个BCP}P细胞予以不同的药物及浓度处理，具体如下:1)131I处理组，即在药物处理组中加人不同浓度131I(1 600,800,400,200、100,50和25 Uci/mL);2)PJ-34处理组，在药物处理组中加人不同浓度PJ-34(50、10,5、1,0.5和0.1}..t,mol/L);3)131I与PJ-34共同处理组，药物处理组中加人400 Uci/mL'3'I和不同浓度PJ-34(10,1和0.1 N,mol/L)共同处理，另外与131I处理组,PJ-34处理组不同的是，此组对照组亦加人400 Uci/mL'3'I每个药物浓度组设3个复孔，置于培养箱中培育72 h后，按照CCK-8说明书进行检测

1.2.3流式细胞术检测细胞凋亡实验分3组，对照组、PJ-34处理组、131I和PJ-34共同处理组，于6 cm的培养皿中进行细胞培养和药物处理，具体处理如下:1)对照组，仅含完全培养基;2)PJ-34处理组，BCPAP细胞按5 x 104/}lL的密度种于含完全培养基的培养皿中，分别加入5 N.,mol/L和10}.},mol儿的PJ-34;3丫31I和PJ-34共同处理组，BCPAP细胞按5x104/皿的密度种于含完全培养基的培养皿中，加人300 U ci/mL的’3,I及不同浓度PJ-34(0,2.5,5和20}.},mol/L)。上述细胞置于培养箱中培育60 h，按照凋亡试剂盒说明书操作，流式细胞仪测定各组细胞凋亡率，FL-1检测Annexin V-FITC荧光信号，FL-3检测PI荧光信号。

1.2.4 Western blot法检测Bcl-2,Bax的表达将BCPAP细胞按5 x 104/I}1的密度种于4个6 cm的培养皿中，分别加人300 Uci/mL的'''I及不同浓度PJ-34(0,2.5,5和20 N.,mol/L)，置于培养箱中培育60 h后提取细胞总蛋白，Western blot法检测Bcl-2和Bax的表达。

1.3统计学处理应用SPSS19.0统计软件讲行分析，所有数据以x1、表示，采用单因素方差分析，以P,0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1 CCK-8检测细胞抑制率‘31I以浓度依赖方式抑制BCPAP的增殖，其抑制率随131I浓度升高而增强(图1)o PJ-34亦能以浓度依赖方式抑制BCPAP增殖，其抑制率随浓度升高而增强(图2),PJ-34浓度)5 N.,mol/L时，与对照组相比差异具有统计学意义(P<0.05)0 131I联合PJ-34对BCPAP细胞的抑制效果如图3,400 Uci/mL 13iI联合10 N,mol/L PJ-34对BCPAP抑制率显著强于400 Uci/mL'3'I(67.4%vs 48.8%，P<0.005)。

2.2流式细胞术检测细胞凋亡不同浓度PJ-34对甲状腺癌BCPAP细胞的促凋亡作用及'3'I(300 UCi/mL)联合PJ-34对BCPAP的促凋亡作用如图4,5。结果表明随PJ-34浓度的升高，其对BCPAP的细胞凋亡作用也升高;而且对比PJ-34单独的作用，PJ-34联合‘31I对BCPAP的凋亡作用更强。

2.3 Western blot检测B c1-2,Bax的表达不同浓度PJ-34联合’}'I作用BCPAP细胞后Bcl-2和Bax的表达见图6。分别给予300 UCi/mL'3'I,300 UCi/mL'3'I+2.5}..}mol/L PJ-34,300 UCi/mL L;LI+5}..i,mol/L PJ-34和300 UCi/mL 13'I+20 N.,mol/L PJ-34}Bcl-2表达量在前2组变化不大，但随PJ-34高于5 N.,mol/L，可见到Bel-2随PJ-34浓度升高表达量降低。当与}s}I共同处理时，随PJ-34浓度逐渐升高，Bax表达量逐渐增加。

3讨论

131I特异性的浓缩在摄碘的甲状腺癌组织中发生日衰变，释放高能电子1606 keV)以电离辐射损伤肿瘤细胞DNA，使DNA裂解，从而杀死摄碘的残留甲状腺癌细胞但在所有接受131I内照射的患者中，仅有1/3患者的病灶对131I吸收较好，治疗效果明显;而另外有约1/3的患者在内照射治疗的初期反应良好，但会在接受数次内照射治疗后发生病灶摄碘率下降、甚至不摄碘的情况，这部分患者往往到治疗后期、病灶还没有完全清除之前出现“无药可治”的状况;最后还有约1/3的患者从治疗一开始病灶就不摄碘，131l治疗根本无效

PARP家族调控DNA修复及转录，对细胞生存及死亡发挥着重要的调控作用，此外它还参与肿瘤发展及炎症反应过程中转录因子的调节，PARP家族中以PARP-1结构最典型，研究也最多s其相对分子质量为116x103，含有一个DNA结合域(DNA binding domain,DBD)、一个自身修饰域(automodifi-ration domain,AMD)和一个C末端催化域P:4RP-1在DNA损伤及产生缺口时激活，活化的PARP-1识别并结合DNA缺口，形成同型二聚体，催化尼克酞二核昔酸(NAD十)降解为烟酸和ADP，通过对受体蛋白的聚腺营二磷酸糖基化修饰作用及自身修饰和聚腺昔二磷酸糖基水解酶的作用，传递细胞受损程度启动DNA修复系统，从而有效地修复DNA损伤6另外，大量激活的PARP-1能触发细胞凋亡信号，诱导线粒体释放凋亡诱导因子(AIF)，使DNA断裂导致细胞凋亡体内外的多项研究均证实抑制PARP-1能增强放疗及多种DNA损伤型化疗药(如烷化剂和拓扑异构酶-1抑制剂)的细胞毒作用，而近来单独应用PARP抑制剂于肿瘤治疗也取得了一定进展.

 PARP-1在DNA修复和细胞凋亡及维持基因组稳定性方面发挥至关重要的作用，它能在DNA受到损伤后被激活，迅速募集到损伤DNA处，通过修复这些损伤从而使细胞重新进人细胞周期2-15，而抑制PARP可降低DNA修复功能。Bryant等16和Farmer等n分别报道了体外实验中单独使用PARP-1抑制剂能明显抑制乳腺癌易感基因(breast cancer susceptibility gene,BRCA卜1-/-和BRCA-2-/-的肿瘤细胞的生长，并在动物模型上证实其能抑制BR-CA-1-/-和BRCA-2-/-肿瘤的生长，而对BRCA-1+八和BRCA-2+/一的肿瘤则无明显抑制作用。这为BRCA-1+/一和BRCA-2+/一肿瘤患者(肿瘤组织为BRCA-1-/-和BRCA-2-/-)应用PARP-1抑制剂特异性治疗提供了新的前景。Martin-Oli二等则报道了体内试验单用PARP-1抑制剂对皮肤癌细胞生长有明显的抑制作用。Huang等也报道了单用PARP-1对肝癌细胞HepG2的生长有抑制效果，并对HepG2裸鼠皮下移植瘤的生长有明显抑制作用。而本研究结果也证实了体外单用PARP-1抑制剂对BCPAP细胞生长同样有抑制作用Brj-ant等和Farmer等认为，PARP-1抑制剂导致单链DNA缺口(single-strand break,SSB)增多，在DNA复制过程中SSB转变为双链DNA缺口(double-strand break,DSB),DSB依赖l源重组(homologue recombination,HR)修复，而BRCA缺陷的细胞同源重组修复能力缺失，DNA损伤积聚，导致染色体失常甚至细胞死亡Martin-Oliva等is认为PARP-1抑制剂通过调控转录因子AP-I的活性及调节缺氧诱导因子一la(hypoxia-inducible fac-tor-la,HIF-la)的表达来实现对肿瘤细胞生长的抑制作用。

近期有研究表明，PJ-34能增加钠一碘共同转运体(sodium/iodide symporter,NIS)的mRl的水平，并导致BCP_4P细胞摄碘的增加，增加1311浓集在甲状腺滤泡状细胞而达到杀伤甲状腺癌细胞的目的。但两者联合发挥肿瘤细胞抑制作用的具体机制尚需进一步研究。本研究发现，131I和PJ-34均能抑制BCPAP细胞的增殖，且与浓度呈相关性，而且用流式细胞术和Western blot法检测发现二者联合作用比单独应用311有更好的抑制效果。综上所述，PARP-1抑制剂PJ-34联合311能抑制BCPAP的增殖并促进其凋亡，本研究为PARP-1抑制剂作为’311增敏剂用于甲状腺癌临床的辅助治疗提供了初步实验依据，为进一步的动物和临床研究奠定了基础。

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