熊果酸对口腔鳞状细胞癌Tca8113细胞周期及凋亡的实验研究
发表时间：2014-08-26 浏览次数：720次
熊果酸(UA)又名乌索酸、乌苏酸,属于旷香树脂烷(α-amyrin)型五环三萜类化合物。五环三萜类化合物是一类重要的天然产物,大多以游离形式或者与糖结合成苷的形式广泛存在于自然界中。UA在自然界分布较广,如在陆英、枇杷叶、熊果、女贞子、山楂、车前草、夏枯草、白花蛇舌草等植物中以游离形式存在或与糖结合成苷存在。大量研究表明,UA及五环三萜同类物具有抗肿瘤、抗HIV、抗糖尿病、抗菌、抗病毒、增强免疫功能和降血脂等多种生物学活性E1□,尤其是其抗肿瘤作用已日益引起人们的重视。本研究以人舌鳞状细胞癌Tca8113细胞为研究对象,采用MTT法、流式细胞仪等方法探讨UA对Tca8113细胞的杀伤作用,以期为临床肿瘤治疗提供依据和参考。
1材料与方法
1.1试剂和材料口腔舌癌细胞株Tca8113购自中南大学湘雅中心实验室,RPMI1640、小牛血清购自GIBCO公司,UA、PI及RNase购自⒏gma公司,四甲基偶氮唑蓝(MTT)和二甲亚砜(DMSO)购自杭州四季青生物工程公司;Annexin V FITC细胞凋亡检测试剂盒购自凯基生物工程公司。
1.2方法
1.2.1细胞培养Tca8113细胞常规培养于RP MI1640完全培养液内(含10%小牛血清、100U/mL青霉素和100U/mL链霉素,pH=7.2),置于37·C、5%C02培养箱中培养,每2d换1次液,当80%细胞融合时传代培养。
1.2.2增殖抑制实验测细胞活性调节细胞浓度至5.0×106/mL,96孔板每孔100uL(相当于每孔5×105个细胞),待细胞贴壁后,分别加人浓度10、⒛、30、40、50umo1/mL的UA,每孔⒛0uL9每个浓度设6个复孔,分别作用24h、72h及120h,空白对照组用等体积的RPMn64o替代UA。培养结束前4h每孔加15uL(5mg/mL)MTT继续培养4h,培养结束时弃去培养基,每孔加150uL二甲基亚砜液,振荡混匀后于酶标仪上进行比色,测定光密度值(A),测定波长为492nm,计算药物对Tcj8113细胞的增殖抑制率。抑制率(%)=(对照组平均A值—实验组平均A值)/对照组平均A值×100%。
1.2.3细胞周期的检测以浓度10、⒛、30、40、50um°l/mL的UA作用于细胞48h,未加药者为对照组,每组收集细胞106个,用70%冰乙醇固定,4C保存;坝刂定时取此细胞离心,弃去固定液,PBS洗涤两次,加人PI染液,4℃避光染色30min,流式细胞仪分析细胞周期。每个实验组重复3次,取其均值。
1.2.4细胞凋亡率的检测以浓度10、20、30、40、50umol/mL的UA作用于细胞24h,未加药者为对照组,每组收集细胞106个,离心去上清,按照Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒说明书进行操作,用流式细胞仪检测凋亡率。每个实验组重复3次,取其均值。
1.3统计学处理应用SPSS13,o统计软件,采用完全随机设计单因素方差分析(oncˉway ANVOVA);多个样本均数间的两两比较采用SNK-g检验。P<0.05示差异有统计学意义。
2结果
2.1 UA的细胞毒作用随着UA浓度的增加和作用时间的延长,细胞的存活率逐渐降低,而细胞增殖抑制作用则明显增强(表1)。由此可见,10~50umo1/L的熊果酸诱导的细胞死亡呈明显的时间和浓度依赖性。50 umol/L的UA作用120h后,舌癌细胞Tca8113的增殖几乎停止。UA在24h、72h及120h3个时间点的IC5。分别为34.56umol/L、33.54umol/L及17.22um°l/L。
2.2 UA对细胞周期的影响UA作用于Tca8113细胞48h后,10umol/mL至50umol/mL浓度UA组G°/G1期细胞由(53.39±1,52)%上升至(61.55±0,48)%;S期由(43.01±0.52)%下降至(32,08±0.8)%;G2/M期由(3.51±1.18)%上升至(6.37土o.49)%。与对照组比较差异有显著性(P<0,05)。见图1。
2.3 UA对细胞凋亡的影响分别用10um。l/mL至50umol/mL浓度的UA处理TCA8113细胞24h,通过流式细胞仪检测细胞的凋亡率,结果显示30umol/mL、40umol/mL及50umol/mL浓度UA作用24h后对Tca8113细胞产生明显的凋亡作用(见图2),各组总凋亡率分别是30,76%、43.77%及70.15%,与对照组总凋亡率11.53%相比较,差异有统计学意义(P<0.05)。
3讨论
舌癌是发生于舌体部位的恶性肿瘤,为口腔、颌面部最常见的恶性肿瘤,其发病率为0.6/10万,占全身恶性肿瘤的0.8%~1,5%,占口腔癌的32,3%~50,6%。舌癌的治疗采用以手术为主的综合治疗方式,但由于位置特殊,手术切除范围受限,且易毁损容貌,因此寻找有效的治疗药物十分迫切。
本研究通过MTT比色法、流式细胞分析法观察UA对Tca8113细胞的增殖、细胞周期及细胞凋亡的作用。通过MTT法检测发现UA对T∞8113细胞的增殖具有抑制作用,且作用具有时间、浓度依赖性,当UA浓度达到50um。l/mL作用72h,细胞增殖基本停止。在用流式细胞分析法检测时发现浓度10um。l/mL至50umol/mL的UA与对照组比较,各浓度组UA将Tca8113细胞阻滞于S期,而S期是细胞内DNA复制、组蛋白和非组蛋白等染色体蛋白的合成期,UA通过抑制T∞8113细胞停滞于S期,使得Tca8113细胞不能进人M期进行分裂,从而抑制了肿瘤细胞的生长代谢:导致肿瘤细胞减少。有研究囵发现UA对多种肿瘤具有广泛的抑制和杀伤作用,其作用主要是通过阻滞细胞周期来实现的。本实验结果也证实了这一观点;同时通过Anncxin V FITC细胞凋亡检测发现随着UA浓度增加,其细胞凋亡率也明显增加。综上所述,本实验证明UA可以抑制人舌鳞状细胞癌Tca8113细胞的增殖,其作用可能是通过阻滞细胞周期和促进细胞凋亡来实现的。此结论可能为进一步研究UA对人舌鳞状细胞癌的作用及将来的动物实验提供基础试验依据。
参考文献
[1]李宏杨,刘国民,刘飞.熊果酸及五环三萜同类物的研究进展[J].湖南工业大学学报,2009,(05):18-20.
[2]张新华,朱萱.熊果酸药理学的最新研究进展[J].中国中西医结合杂志,2011,(09):1285-1289.
