C57BL/6小鼠幽门螺杆菌感染胃炎模型的复制

幽门螺杆菌(HP)是寄生于人体胃内的草兰氏微需氧杆菌,自1983年澳大利亚学者Warren和Mar-曲all从胃黏膜中分离出后,众多的研究发现HP感染与慢性胃炎、消化性溃疡、胃癌和胃黏膜相关淋巴样组织(MALT)淋巴瘤的发病相关E1]。HP是一种人胃壁的寄生菌,不容易在动物繁殖,因此HP感染动物模型的建立成为研究的难点与热点,也是研究HP相关疾病的致病机理及演变过程、观察HP对胃黏膜的毒性作用、筛选根除HP药物以及研制抗HP疫苗的关键。目前,研究HP感染的动物模型主要集中在蒙古沙鼠、BALB/c小鼠、67BL/6等小型实验动物[刈。其中,小鼠因其遗传背景明确、个体差异小、有很多品种品系、容易饲养繁殖、费用低廉等优点,成为目前应用最广泛的HP感染动物模型。本实验在清洁级环境中将HP标准菌株SS1灌服给预先用碱处理的C57BL/6小鼠,复制小鼠HP感染模型,引起小鼠胃黏膜病理改变,以期建立一种造模周期短且可靠的HP感染的慢性胃炎模型。

1材料与方法

1,1材料

C57BL/6小鼠10周龄,雌雄各半,体质量18~22g,由贵阳医学院动物饲养中心提供,动物质量合格证号:生产许可(渝)20070005,第三军医大学大坪医院实验动物中心;哥伦比亚琼脂购自CM0331B英国OXOID公司;0,2%HP选择添加剂购自青岛市海博生物技术有限公司。

1.2方法

1,2.1细菌的培养HP菌株SS1培养基为哥伦比亚琼脂(10%脱纤维绵羊血,0,2%HP选择添加剂),置37℃微需氧环境中培养。

1.2.2模型复制方法清洁级环境饲养C57BL/6小鼠88只,分成三组:模型组(刀=40),随机分为A1、B1、C1、D1四组,雌雄各半,每组10只;空白对照组(″=8)为E组,雌雄各半;培养基组(″=40),随机分为A2、B2、C2、D2四组,雌雄各半,每组10只。模型组小鼠灌胃前禁食禁水12h,均灌胃0,5mL0.1mol/L NaHCO3,1h后分别灌胃SS1标准菌株(经标准比浊管调整浓度为10⒐1°CFU/mL)0,5mL,灌胃后禁食禁水4h,隔天灌胃1次,共灌胃5次。培养基组将模型组的SS1标准菌株更换为标准菌株培养基,用生理盐水调整其浓度为。CFU/mL,余条件与模型组相同。空白对照组不予任何处理。经末次灌胃后2、4、6、8周分批处死小鼠,胃黏膜行快速尿素酶试验、HE染色及Warthin Starry银染,观察HP在小鼠胃内定植及胃黏膜病理组织学变化情况。

1,2,3快速尿素酶试验取胃窦黏膜组织,用无菌组织剪绞碎后,用无菌环取少量组织行尿素酶试验,参照尿素酶试纸说明方法进行,试纸由黄变红为阳。

1,2.4胃组织病理学检查将一部分胃组织固定于10%甲醛中,行HE染色[5]及Warthin Starry银染色。

1.2,5胃黏膜病理改变标准确定参照中国慢性胃炎共识意见。按淋巴细胞和单核粒细胞密度及浸润深度对胃炎做如下分级评分:0=单个核细胞每高倍视野不超过5个;慢性炎症细胞较少并局限于黏膜浅层,不超过黏膜层的1/3;2=慢性炎症细胞较密集,超过黏膜层的1/3,达到2/3;3=慢性炎症细胞密集,占据黏膜全层。计算密度程度要避开淋巴滤泡及其周围的淋巴细胞区。

1.2.6 HP定植判断标准[刚高倍镜下观察10个视野胃小凹的HP定植情况,以定植量的多少进行计分:0=无HP定植;1=胃小凹有1~2条HP,但不是每个胃小凹都有细菌存在;2=多数胃小凹有3~10条HP;3=几乎所有胃小凹均有成堆HP。

1.3统计学处理分析实验结果以mean±SD表示。多组间率的比较∏sher’s精确概率法检验,同一时间内模型组与培养基组小鼠胃黏膜评分,两两比较用∠检验;培养基组内小鼠黏膜炎症评分对照用方差分析;模型组内各组炎症评分对照用方差分析;模型组内各组间HP定植评分对照用方差分析。所有数据统计均用统计软件SPSS16.0软件进行处理,检验水准α=0.05,P<0.05示差异有统计学意义。

2结果

2.1小鼠胃黏膜切片HE染色结果比较小鼠胃黏膜切片HE染色结果见图⒈2。

2.2尿素酶实验结果培养基组尿素酶实验阴性。模型组末次灌胃2周后2只小鼠尿素酶实验弱阳性,1只阳性;4周后4只小鼠尿素酶实验阳性,1只弱阳性;6周后7只小鼠尿素酶实验阳性;8周后9只小鼠尿素酶实验强阳性。

2.3小鼠胃黏膜炎症评分比较空白对照组与培养基组小鼠胃黏膜炎症评分差异无统计学意义(P±0.712),空白对照组与模型组炎症评分比较差异均有统计学意义(P<0.01),培养基组与模型组炎症评分比较差异均有统计学意义(P(0.01);模型组灌胃后2周、4周、6周、8周胃黏膜炎症评分比较差异均有统计学意义(P<0.05,P=0,000)。见表1。

2.4 Warthill Starry银染结果模型组末次灌胃2周后胃黏膜即有HP定植,2、4、6、8周小鼠AP的感染率分别为3Q%、50%、70%、9o%,四组感染率经Flsher’s精确概率法检验差异有统计学意义(P(0.05)。见图36。

2.5模型组HP感染率比较模型组末次灌胃2周后胃黏膜即有HP定植,2、4、6、8周的感染率分别为30%、50%、7o%、90%,灌胃后2周与灌胃后4、6、8周感染率比较差异有统计学意义(P(0.05),后三者比较,感染率差异无统计学意义(P)0。05)。见表2。2,6 HP定植评分比较感染后2、4、6、8周各组感染HP定植评分比较,差异有统计学意义(P(0.05)。见表3。

3讨论

国内外学者对HP感染动物模型进行了大量的研究,最初成功建立了雪貂、小型猪等动物的HP感染模型,但此类模型价格昂贵、操作繁琐,各种处理因素不容易控制,不适合大规模的研究E9]。目前,研究HP感染的动物模型主要集中在蒙古沙鼠、BALB/c小鼠、C57BL/6等小型实验动物。小鼠因其遗传背景明确、个体差异小、有很多品种品系、容易饲养繁殖、费用低廉等优点,成为目前应用广泛的HP体内感染模型动物[10]。,普通级的小鼠因胄内杂菌太多而被放弃使用建立HP感染动物模型难度较大,主要与宿主的特异性有关。清洁级动物指动物体内外不携带人畜共患的病原体或动物传染病病原体的动物。本实验选取了C57BL/6小鼠,采用清洁级环境饲养造模,既易于HP的定植,也模拟了人类的菌群状态,且耗费相对较低,便利实用。1997年Lee等[11□将新鲜分离的临床HP菌株长期感染小鼠,逐步筛选出适应小鼠胃环境的驯化株,命名为SSl,可以持续定植于多种遗传背景小鼠。本实验选用SSl标准菌株灌胃小鼠进行造模,且给予灌胃高浓度的SSl即10⒐I°CFU/mL,提高了成功率。HP适应弱酸性环境(pH值为5.5~6.5),正常MG胃内pH值为0.9~1.8。本实验中每次接种HP前先予碳酸氢钠中和胃酸,以提高胃内pH值,同时在小鼠胃内制造化学性溃疡,使黏膜层受到损伤,以利于HP顺利通过黏膜层而定值,为HP定植提供了更为有利的环境,从而提高定植率。喂服HP前、后禁食,有利于HP定植。其原因可能是进食可以促进胃酸分泌,禁食则可以保持胃内中性环境,有利于HP的定植。但灌胃本来就是对小鼠胃黏膜的损伤,故禁食时间不能太长,以免造成小鼠的死亡。目前染色方法很多,包括HE染色、Gemsa染色、间接免疫荧光染色、石炭酸复红染色、Warthin-⒊arry银染色等,但由于染色方法不同,敏感性、特异性有所差异,其中Warthi艹Starry银染色效果最好,其次为Giemsa染色、Grams染色和HE染色。本实验采用了效果较好的银染色方法及HE染色。实验结果提示随造模时间延长及造模次数增多,小鼠胃黏膜的炎症程度逐渐加重,定植数量逐渐增多,感染阳性率逐渐增高。造模时间长的小鼠,HP定植数量逐渐增多原因考虑:(1)随灌胃次数的增多,定植于胃黏膜表面的HP数量也增多,从而使HP的定植量也逐渐增多;(2)先前体内灌胃感染的HP定植于胃黏膜表面后不断传代繁殖,故定植数量也越来越多。尿素酶实验结果随时间延长表现出阳性强度逐渐增强。本实验中HP主要定植在胃窦部及胃窦/胃体交界部,并可导致慢性浅表性胃炎,病变组织有逐渐加重的趋势,与人类HP感染病变有相似性。但本实验因时间关系,未能做更长时间研究,小鼠胃黏膜变化及HP定植情况尚需进一步深入研究。

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