发酵罐中蔗糖流加控制和pH调控对乳酸链球菌素产量的影响

乳酸链球菌素(nisin)是由乳酸乳球菌(肠c莎ococcⅡs拓c莎js)产生的一种羊毛硫抗生素[ll,是由“个氨基酸残基组成的分子量大小约35OODa的多肽12,能够抑制大多数革兰氏阳性细菌的生长。nisin被普遍认为是安全、无毒的产品,囚此作为天然的防腐剂广泛应用在食品工业中[3]。目前人们已经发现lll茁n分子有6种类型,分别为A,B,C,D,E,Z,其中又以l△lsin A和血lll Z两种类型的研究最为活跃,二者的差异仅是在夕位氨基酸的种类有所不同,nisin A是组氨酸(Hls),而血sin z是天门冬酰胺(虬n),在同样浓度下,nisin Z的溶解度和抑菌能力比nlsin A要强[4‘J。血卣n的生产受到一些发酵条件的影响,如产生血sh的菌株、培养基营养成分、pH、培养温度、搅拌、通气等,另外底物和产物的抑制、菌体细胞对血sin的吸附作用以及蛋白酶对血slll的降解作用都影响耐凶n的产量。因此,ni茁n的生产和广泛应用也受到了限制[6]。其中碳源尤其是蔗糖影响着菌体细胞的生长和血葫n的合成[7]。St∞1e等[:]发现蔗糖的代谢与血葫n的合成之间有着密切的联系,而且蔗糖浓度对于血sin合成具有重要的调控作用,适当提高蔗糖浓度可以提高菌体浓度及乳酸链球菌素效价,但过高的蔗糖浓度会抑制乳酸链球菌素的合成[7J。虽然可以通过限制生长的营养供给策略来缓解过高的起始蔗糖浓度所引起的抑制作用[9]。然而,准确的蔗糖浓度很难在线监控,因此很难通过简单的补料策略来控制蔗糖保持最佳的浓度。乳酸乳球菌发酵过程中生成大量的乳酸链球菌素,并伴有副产物乳酸的产生,乳酸的存在使得发酵液pH降低,从而抑制了菌株的生长和代谢,同时乳酸链球菌素对pH敏感,因此有必要通过流加碱液来控制发酵液在适宜的pH范围内[10],所以本文试图从发酵过程中的pH和补料调控来促进乳酸链球菌素的生物合成。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1菌株乳酸乳球菌(L@c古ococc泌JαCJ氵sM01菌株)为本实验室筛选获得并保存的而蚯nz生产菌;指示菌藤黄微球菌。

1.1.2培养基及其他试剂(1)培养基:CM1培养基(蔗糖10g,蛋白胨10g,酵母膏10g,ΚH2Po410g,NaC12g,MgS0402g,pH68,水1000ml),30℃,100√雨n摇动培养;效价检测培养基:(蛋白胨8g,酵母膏5g,葡萄糖5g,NaCl 5g,N%HPO4·12H202g,吐温⑽10ml、琼月旨7.5g,pH值6.8,水1000ml);指示菌藤黄微球菌:Ⅲ培养基(蛋白胨8g,酵母膏5g,葡萄糖5g,NaC15g,Na.HPo4·12H202g,吐温沼010ml、琼月旨7,5 g,pH值6,8,水10OO ml),37℃静置培养。(2)洫血标准溶液:血sin标准品(106IU/g,购于⒌gma公司),准确称取~。^00mgsin标准品,溶于50ml无菌的盐酸溶液中,配成104IU/ml的血sin标准溶液各用。使用时,以无菌的盐酸溶液为稀释液,制备所需各种效价的血“n标准液。(3)蒽酮试剂:1g蒽酮加人8O%的稀硫酸(80ml浓硫酸加人20ml蒸馏水配制而成)中。(4)2mol/L KOH溶液。(5)标准糖贮各:准确称取笏0mg干燥的分析纯蔗糖,溶于水并定容至200ml,浓度为1mg/ml。(6)标准糖工作液:吸取10ml标准糖贮备液于100ml容量瓶中,用水稀释至刻度,摇匀,浓度为100ug/ml。

1.1.3实验器材及设各5L发酵罐(Blotech-5BG-2000型,上海保兴生物设备有限公司),牛津杯(内径6.0±0.1mm,夕卜径7,8±0.1mm,高100±0.1mm),培养皿(内径20mm,高16~17mm),游标卡尺,超净工作台(T缸血e,中国);恒温培养箱(DHP-9082,中国);分光光度计(UV/ⅤIS20⒆PC,美国);pH酸度计(MEΠCLER TOLEDO LE438,中国);电子天平(中国);分析天平(咄⑽4B,中国);小型高速离心机(s唿ma1-14,德国)。

1.2方法121分析方法(1)菌体量测定:菌体生长以波长为ω0nm处的吸光度值表示,用同样稀释度的同种培养基作对照。(2)Nh血效价测定:以无菌的pH为2的盐酸溶液分别稀释至200、300、硐0、∞0、ω0、⑽0、1000IU/ml的nisin溶液对藤黄微球菌抑菌活力为标准,用生物抑制法测定发酵产物的lll⒍n活力单位。蔗糖含量测定采用硫酸蒽酮比色法。(3)蔗糖含量测定步骤:①绘制标准曲线吸取0、02、04、06、0.8、1.01nl的标准蔗糖工作液,置于9~s nll比色管中,并补水至2ml,加人6Illl蒽酮试剂,于沸水浴加热10mh,迅速冷却,静置10mh,@0nm,25px比色皿,0号管为空白,测定吸光度,以蔗糖量为横坐标,吸光度为纵坐标,绘制蔗糖标准曲线。②发酵液中糖的提取取发酵液11nl于2ml离心管中,100O0g离丿b2mln,将上清液转移至50nll容量瓶中,再向含有沉淀的离心管中加入mll水,吹洗悬浮,10OO0g离心2血n,将上清转移至上述~sOml容量瓶中(重复2次),加水稀释至刻度。此液用于蔗糖的测定(A液)。③蔗糖的测定吸取A液10ml,加人2mol/L KoH溶液2ylal,置沸水浴中加热10mln,取出迅速冷却至室温,加水稀释到50nll,摇匀。吸取稀释液21nl,按标准曲线绘制步骤测定吸光度。从蔗糖工作曲线求得蔗糖质量S。

1.2,2实验方法(1)培养条件乳酸乳球菌接人摇瓶种子培养基,在30℃摇床中1001/mh培养12h,作为种子液,按体积分数为1%的接种量接人5L发酵罐中。5L发酵罐装料量为3L,温度5O℃,通过蠕动泵自动流加5m。l/L的NaoH或蔗糖溶液。轻微搅拌(1OⅣ而n)保持发酵液均一,间隔1h取样分析。以同样的实验方法,进行不流加NaOH或蔗糖溶液的实验,作为对照。(2)pH调控使用5m。l/L NaOH,发酵自动控芾刂pH为6.8。(3)补料发酵根据相关研究的结果,选择1%蔗糖起始浓度的发酵液,开始发酵5h后,按2g/L·h和4g/L·h的流加速度流加蔗糖溶液至发酵终点。

2结果与讨论

2.1发酵过程控制pH值对msin合成的影响由图2可看出,随着发酵时间的进行,在3~13h时,菌体密度(oD6∞)逐渐上升,在14h时略有下降,而且在发酵罐中发酵11h左右达到lll蚯n最大产量3873IU/lnl,sln产量快速增长期对应于菌株生长曲线对数增长期,由图2可以看出,pH过低成为菌体生长限制的主要因素,因而pH可能成为限制血sin产量的第一要素,因此,在发酵过程中有必要恒定pH发酵。

2.2 MO1在发酵罐中调控pH的发酵测定在5L发酵罐中加人3LCM1培养基,按1%接种量接入活化2代的z^cIcJ°cocCzrs J@c莎泌N401种子液,30℃、1OOl/m血发酵,发酵过程中流加NaOH溶液(5m。l/L),发酵液pH恒定为6.8。间隔一段时间测定吸光值oD600、pH、血蚯n效价和发酵液中蔗糖的含量,结果如图3、4所示。由图4可以看出,z@c莎ococc“sJ@C苫泌N401在恒定pH为6.8的条件下发酵,在9h时所产洫血效价最高,为笱14IU/ml,与未调控pH发酵相比,lll“n效价提高了1,2倍。由图4可以看出,乙cc苫0cocc泌J@C扌js N401在恒定pH为68的条件下发酵,8h后菌体的生长已经很缓慢。主要是因为发酵液中蔗糖消耗很快,在8h已近乎为0,这时,碳源已成为限制血蚯n产量的最主要因素,但若培养基中蔗糖过高,则会抑制nl蚯n的合成,根据文献[9]选择1%的起始蔗糖浓度,在恒定pH发酵过程中流加蔗糖。从图3可以看出,在6h左右菌体已消耗掉ω%的初始培养基中的蔗糖,因此选择发酵开始5h后流加蔗糖。

2.3ΙJOcocCs切C泌NuO1在发酵罐中调控pH、补加蔗糖发酵测定N401在5L发酵罐中发酵,恒定培养基pH为6.8,发酵5h后,分别以2g/L·h和4g/L·h的速度开始流加蔗糖。测定的菌体生长曲线、nisin效价、pH以及蔗糖含量变化如图5。由图5~图7可以看出,以4g/L·h速度流加蔗糖比2g/L·h速度流加蔗糖菌体生长量要高,产生沁in的最大量也有所提高(提高5,7%)。而且,以2g/L·h速度流加蔗糖,在9h蔗糖含量几乎为0,有可能限制了Ⅱs血的合成,因此,选择以4g/L·h的速度流加蔗糖,Ⅱsh最大产量在10h出现,效价为5831IU/ml,比未优化发酵条件的血蚯n产量提高了50,5%。3结论本实验使用初楫质量浓度为10g/L的培养基,发酵至5h,采用恒定pH的调控方法(从发酵开始至发酵结束恒定pH为6,8)按4g/L·h恒速流加蔗糖溶液,乳酸链球菌素最高效价达到5831IU/lnl,比对照实验的效价(3813IU/ml)提高约505%,DeⅤuyst等[7]通过蔗糖调控使得lllsin的产量提高了20%,而刘亚丽等[16]通过同时调控蔗糖和pH,按照5g/L·h恒速流加蔗糖溶液,乳酸链球菌素效价提高约29倍(乳酸链球菌素最高效价达到弱∞TU/nll)。微生物的发酵是一个不断变化的复杂的过程,需要根据菌体生长情况和发酵液中各种参数的变化,做出最佳的调整,提高所需代谢物的产量。乳酸乳球菌LacJOcoccI/sJ0C扌赤N401在发酵过程中菌体密度与血蚯n产量具有相关性,主要在对数期产生。当菌体生长进人稳定期后,部分血sin吸附在菌体表面,且菌体产生的一些分泌胞外蛋白酶会分解血蚯n,导致血slll效价降低,因此要严格控制发酵时间发酵时利用蔗糖产生大量乳酸,引起发酵液pH的下降,由于乳酸乳球菌不耐酸,从而抑制了菌体的生长,导致血由n的产量减少,因此需要在发酵过程中流加碱液稳定pH,相关研究中表明碳源是限制产量的最主要因素,而培养基中的高蔗糖浓度又会抑制菌体生长,因此需要发酵过程中不断补加蔗糖。通过控制pH和补加蔗糖改进发酵工艺,血蚯n产量比未优化前提高了50,5%.说明可以通过补料和pH调控来提高血sin的产量。另外随着对血血生物合成途径中基因的结构和功能的了解和市场血⒍n的需求扩大以及分子生物学技术与理论的成熟,人们逐渐将目光转向通过转基因手段获取高产lll葫n菌株,并取得一定的进展。⒗m等[20]将与血凶n生物合成相关的调控和免疫基因砒RK、瓦G构建在一个16岫的载体pND300上,在乙.J@cATCC11454中过量表达后,工程菌生长速度加快,而且血sh产量也提高了20%左右,这也启示我们利用基因工程手段改造缸sin产生菌以提高血sin的产量及血蚯nz的大规模生产从而提高经济效益。

[1]Cheigh C I,Park H,Choi H J.Enhanced nisin production by increasing genes involved in nisin Z biosynthesis in Lactococcus lactis subsp.lactis A164[J].{H}Biotechnology Letters,2005,(03):155-160.

[2]Vuyst L.Nutritional factors affecting nisin production by Lactococcus lactis subsp lactis NIZ022186 in a synthetic medium[J].Journalof Applied Microbiology,1995,(01):28-33.

[3]Kim W S.Nisin production by Lactococcus lactis using two-phase batch culture[J].{H}Letters in Applied Microbiology,1997,(03):169-171.

[4]De Vos W M,Mulders J W,Siezen R J.Properties of nisin Z and distribution of its gene,nis Z,in Lactococcus lactis[J].{H}APPLIED AND ENVIRONMENTAL MICROBIOLOGY,1993,(l):213-218.

[5]Laridi R,Kheadr E E,Benech R O.Liposome encapsulated nisin Z:optimization,stability and release during milk fermentation[J].{H}International Dairy Journal,2003,(04):325-336.

[6]Parente E,Ricciardi A.Production,recovery and purification of bacteriocins from lactic acid bacteria[J].{H}Applied Microbiology and Biotechnology,1999,(05):628-638.

[7]De Vuyst L,Vandamme E J.Inflaence of the carbon source on nisin production in Lactococcus lactis subsp.lactis batch fermentations[J].{H}Journal of General Microbiology,1992,(03):571-578.

[8]Steele J L,McKAY L L.Partial characterization of the genetic basis for sucrose metabolism and nisin production in Streptococcus lactis[J].{H}APPLIED AND ENVIRONMENTAL MICROBIOLOGY,1986,(01):57-64.[9[9]8

[9]Callewaert R,De Vuyst L.Bacteriocin production with Lactobacillus amylovorus DCE 471 is improved and stabilized by fed-batch fermentation[J].{H}APPLIED AND ENVIRONMENTAL MICROBIOLOGY,2000,(02):606-613.

[10]Van't Hul J S,Gibbons W R.Neutralization/recovery of lactic acid from Lactococcus lactis:effects on biomass,lactic acid,and nisin production[J].{H}World Journal of Microbiology and Biotechnology,1997,(05):527-532.