以MERS-CoV主蛋白酶为靶点的药物筛选体系的建立及应用

2012年初,一名沙特男子感染新型冠状病毒死亡[l]。同年9月,一名卡塔尔男子也感染了这种病毒[2],之后该病毒相继在中东其他国家及欧洲蔓延,至今导致舛人感染,死亡率达到50%[3]。经世界卫生组织证实,这种新型冠状病毒与SARS病毒同属一个家族。因于2012年在中东首次被鉴定出来,将其命名为中东呼吸综合征冠状病毒(⒕ddle East respiⅢoly syndrome coronavims,MERS-CoV)[4]。该病毒能够引起人下呼吸道感染,症状表现与SARs相似,其病毒基因组分析显示与蝙蝠身上发现的冠状病毒HKU4、HKU-5具有很高的同源性。Memiqla等[7]的最新研究进展表明这种冠状病毒与沙特阿拉伯一小种群蝙蝠的核酸序列相似度为100%,证实了其来源,并推测可能存在其他传播载体。之后Reusken等[:]又发现该病毒可能以单峰驼作为传播中介,传入中东。新的晶体结构揭示这种新型冠状病毒能以宿主细胞表面二肽基肽酶DPM作为功能受体,通过病毒表面S蛋白与DPⅡ结合,介导病毒融合,从而激发感染。

MERS-CoⅤ作为单股正链的RNA病毒,基因组可作为mRNA直接与核糖体作用表达蛋白。位于其基因组5′末端的基因区包含两个相互重叠的编码区,分别为复制酶多蛋白pp1a和复制酶多蛋白pp1ab,这两个酶多蛋白对病毒在人体内的复制和转录起着非常重要的作用,复制酶多蛋白上含有约16个左右的功能亚基,只有当这些功能亚基被病毒编码的蛋白酶切割成独立的蛋白单元,病毒才能完成正常的转录、复制功能,而承担这一水解功能的就是主蛋白酶NSP5[11J2],因此在药物研发中成为一个重要的靶点。MERs-∞Ⅴ的主蛋白酶是一种半胱氨酸蛋白酶,分子量约为贸kDa,主要以同源二聚体的形式存在,且每个单体包括3个结构域。结构域I与结构域Ⅱ主要由反平行的β折叠构成,结构域Ⅲ包含了5个∝螺旋。底物结合位点和催化中心Cys148-HM1位于结构域I、Ⅱ间的缝隙中。

MERS-CoⅤ主蛋白酶NsP5与抑制剂之间主要通过形成共价键及氢键发生结合(图1[l’])。针对冠状病毒药物研发的路程是比较缓慢的.早在非典之前,人们就开始了对冠状病毒及其抑制剂的研究,Zlebuhr等[:]发现了3,4-dichloroisocoumarin、PMSF、TLCK和Peh1oc℃等对人类冠状病毒”9E(The human colonavims”9E,HCoV-229E)主蛋白酶的活性有很强的抑制作用,因其专一性差、毒副作用大而没有应用于治疗。非典时期,科学家们试图利用SARS∞Ⅴ本身潜在的靶点来设计药物,如针对RNA聚合酶、S蛋白、N蛋白、主蛋白酶ⅡJ6]等病毒重要组分研发抑制剂或抗体来阻断病毒的入侵、复制及转录,但开发新药风险大、临床试验用时长,至今仍无针对冠状病毒感染的特效药上市。目前寻找比现有药物更加优良的新药已日渐困难,且人们对新药安全性及有效性的要求也越来越高,基于MERS∞Ⅴ主蛋白酶在病毒复制转录过程中的重要性,需要以其为靶点建立药物筛选体系,以期获得尽量多的先导化合物用于药物开发。

1材料与方法

1.1材料及仪器重组质粒pE⒎SUMO-NSPs(载体抗性为卡那抗性,构建重组质粒时于目的基因氨基端插人小泛素样修饰蛋白序列以及6个连续组氨酸序列)为清华大学提供。大肠杆菌B⒓1(DE3)感受态细胞购于北京全式金生物技术有限公司。JN-3000plus低温超高压连续流细胞破碎机购自广州聚能生物科技有限公司。SORⅤALL RC‘plus高速冷冻离心机、Flu。ro酞all Ascent荧光读数仪购自Tllermo Labsystems公司(Finland)。荧光底物MCA-AⅤLQscFR-Lys(Dnp)-Lys¨NH2购自GL Biochem公司(China)。二甲基亚砜(DMS0)等化学试剂为市售分析纯。泛素样特异性蛋白酶(tlbiqotin like叩eci伍c protease,ULP)由本实验室制各提纯。待筛选化合物为本实验室化合物库保存,共200种。

1.2目的蛋白的表达与纯化重组质粒转化至大肠杆菌B⒓1(DE~3),37℃培养12~16h。挑取单克隆接种至51nl含卡那霉素的LB培养基中,37℃刀0'lllln培养过夜。培养后的菌液接种人200nll含卡那霉素的LB培养基中200√耐n摇瓶扩大培养至0D值约为0.6时,加人终浓度为01mm。l/L IPTG,16℃继续培养诱导表达20h。培养后的菌液于4℃550O'而n离心15而n,弃上清,收集菌体,并用301nl缓冲液[20mmol/L△is HCl(pH80),150mm。l/L NaCl,4mmol/L MgC12]重悬菌体。100MPa压力下破碎细胞后,4℃15000'min离心301111n,取上清液流穿Ni2+-NTA琼脂糖凝胶柱。结合了融合蛋白的Ni2+羽TA琼脂糖凝胶柱用含20mm。l/L咪唑的重悬缓冲液冲洗去除杂蛋白,加人ULP4℃柱上酶切过夜(酶切缓冲液为重悬缓冲液)。去除标签后的目的蛋白换成含有10mm。l/L NaCl的重悬缓冲液,通过阴离子交换层析柱Resclurse Q(GE Healthcare,USA)得到纯度高且电荷均一的目的蛋白。

1.3药物筛选体系的建立及应用

1.3,1药物筛选体系的建立本模型中以MCA AVLQSGFR-Llis(Dl·p)-”s-NH2作为N叩5酶活检测荧光底物[12’⒘]。当无酶的作用时,底物上荧光淬灭基团Dnp与荧光基团MCA作用,使不发荧光,当存在酶的作用时,底物于QS之间被剪切开,MCA游离并能在320nm的激发光下发射波长为们5mm的荧光。荧光值通过Flu。roskan虬cent荧光读数仪检测,反应温度为30℃。通过优化缓冲液pH、盐离子浓度、计算EC:0与Km,以确定体系中缓冲液成分、蛋白浓度和底物浓度。

1.3.2抑制剂的筛选方法用%%的DMSo溶解底物和待筛选化合物,储液浓度为0,8mmol/L、100nlmol/L。酶缓冲液稀释蛋白至浓度为2,5umol/L。%孔板中分别加人叨△l蛋白溶液和1淤化合物储液,对照组加人等体积%%的DMsO溶液,20℃孵育10“n后加人2淤底物储液混匀5s,立即检测,并计算抑制率(Inh枷tlonra"o,△)。%孔板中分别加人叨△l蛋白溶液,后加人2【bl底物储液混匀5s,立即检测,反应平衡后加人1d化合物储液,对照组加人等体积呖%的DMSO,再次检测,计算淬灭率(Quel·chllg nⅡo,0r)。抑制率与淬灭率计算公式可表示九J,l异硎‰o=咿×100%(‰:对照组反应初速度;⒕:测定组反应初速度;Q!:对照组最大信号值;Q2:坝刂定组最大信号值)。将△)SO%、o<20%的化合物储液进行梯度稀释,按上述方法再次测定,以抑制率为纵坐标,化合物浓度对数值为横坐标拟合求得IC50值。

2结果

2,1 NsP5的表达与纯化通过亲和层析、离子交换等步骤,纯化后目的蛋白的浓度约为笏m酽llll,SDS-PAGE及Westem blot检测结果如图2。图中于~10kDa处可见清晰条带,无明显非目的蛋白混杂,蛋白提纯效果较好,可用于后续药物筛选体系的建立。

2.2药物筛选体系的建立

2.2.1缓冲液及pH对酶活性的影响将目的蛋白溶解于不同pH的缓冲液中,加人底物检测后计算酶促反应初速度.根据酶促反应初速度与缓冲液pH作图(图3),可知在0,1m。l/L PBS(0,1mol/L KH2POⅡ01md/L N%HPO4,pH72)中,反应初速度最高,酶的活性最好。

2.2.2离子强度对酶活性的影响将目的蛋白溶解于含有不同浓度N硐1的缓冲液中,加人底物检测后计算酶促反应初速度。根据酶促反应初速度与Nacl浓度作图(图4),可知,反应体系中Nacl浓度为0mm。l/L时,反应初速度最高,酶的活性最好。采用相同方法检测KCl、MgC12,发现其浓度的增加或降低对酶活性无明

2.2.3蛋白浓度的确定固定底物浓度为20um。l/L,蛋白浓度从20um。l/L进行梯度稀释,共8个梯度,检测后根据最大荧光值与酶浓度对数值作图(图5),计算EC:0值2.5umol/L。

2.2.4 Km的测定固定蛋白浓度为2.5umol/L,底物浓度从SOum。l/L进行梯度稀释,共8个梯度,检测后由米氏方程计算Km值约为16um。l/L(图6)。

2.2.5药物筛选体系的评定以MERs-∞V主蛋白酶为靶点建立的药物筛选体系为:反应体系中酶的浓度为2.5umol/L,底物浓度为16um。l/L,酶促反应缓冲滋交为0,1m。l/L PBS(0.1mol/L KH2P04,0.1mol/L N%HP04,pH72)。“通过计算z因子对建立的药物筛

3讨论

药物筛选技术作为一项现代药物开发过程中检验及获取活性成分的一个关键步骤,其实质就是采用规范性的操作从大量化合物中筛选出对某一特定作用靶点具有理化活性的化合物的过程,具有灵敏、快速、高效等特点。目前药物筛选技术已成为寻找新药的主要途径之一,因此建立适合的药物筛选体系具有重要意义。MERs-CoⅤ的主蛋白酶在病毒的整个生活史中起关键调控作用,在病毒转录、复制过程中承担不可或缺的功能,是重要的药物设计靶点。本研究利用原核表达系统,大肠杆菌B⒓1(DE3)表达重组MERs-CoV主蛋白酶NsP~s,以NsP~s为靶点,通过优化反应条件及确定酶与底物浓度,建立药物筛选体系,通过测定z因子(z factor=o。>0.7)对体系进行评估可知建立的药物筛选体系较为理想,适用于抑制剂的筛选。运用建立的药物筛选体系筛选实验室化合物库中200种化合物,其中MDCCCLO01515、MDCCCLO01⒓4、MDCCCLO01525、MDCCCL002226、MDCCCL002228以及MDCCClCl∞330对Ns阝活性具有很高的抑制作用,并测得这些化合物的IC50值,以MDCCC20⒆330的ICm值最低,抑制效果最好。筛选体系的建立、应用以及先导化合物的发现为药物设计提供了结构基础,以利用后续的复合体结构研究来进一步揭示MERs￡oV主蛋白酶的底物识别催化机制,并以先导化合物为基础进行结构修饰,开发新型抗MERs-CoⅤ药物。目前针对MERS-CoⅤ主蛋白酶抑制剂的筛选以及主蛋白酶与抑制剂的共晶试验还在进行中,由于先导化合物的发现具有随机性,我们还将结合计算机模拟筛选技术来加快这一进程。同时我们还将对筛选得到的先导化合物进一步合理优化,以得到药效好、药学性质稳定的药物。

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