脑胶质瘤IDH2基因突变HRM检测方法的初步建立

异柠檬酸脱氢酶JDJJ,基因在临床研究中具有重要的意义,JDfr9基因定位于15q26.1,编码的异柠檬酸脱氢酶存在于线粒体中,参与TCA循环,催化异柠檬酸生成α-酮戊二酸,与细胞缺氧诱导因子(ⅢF)稳定性相关,当JElJf,发生突变时会间接刺激HIF1奴通路的激活,从而诱导葡萄糖载体1,血管内皮生长因子,磷酸甘油酸酯激酶等的表达上调,最终引起胶质瘤的发生。JDI~9突变发生于R1”位,导致精氨酸被甲硫氨酸代替,JEl”在WH0Ⅱ-Ⅲ级胶质瘤和继发胶质母细胞瘤中突变率较高[6∶,此后,已有文献报道在继发性胶质母细胞瘤,低级别弥漫性胶质瘤,间变性星形细胞瘤中有JD形基因突变的患者有良好的预后效果。因此通过检测JDfr,突变,可以对胶质瘤患者的手术、放化疗反应及预后作出一定的预测,从而协助指导临床工作。此外,结合JD”突变和其它分子事件可以对胶质瘤进行分型鉴定。尽管已有文献报道采用qPCR-HRM检测胶质瘤组织JD彬突变,但未对PCR参数进行优化;也未见与直接测序法的对比和方法稳定性的评估.目前也没有检测IIlH2突变的抗体,因此不能用免疫组化和g的方法进行检测。目前检测JD夕突变主要是通过PCR“CP、DNA直接测序、焦磷酸测序、限制性片段长度多态性(RFLP)等。这些方法均有其缺点:DNA直接测序虽然是突变检测的“金标准”,但敏感性较低,要求突变等位基因频率在笏%以上,难以进行高通量检测;SSCP和RFLP方法繁琐、需要PCR后电泳;焦磷酸测序仪器昂贵。HRM技术不受碱基位点与类型局限,任何突变类型都能检测到,具有高特异性、高敏感性、高通量及价格低的优点。目前还没有过关于JDfr,基因方法建立的研究报道,本研究通过大量的优化实验、对比实验、稳定性评估以初步建立fD”基因HRM方法,为临床工作提供借鉴。

1材料与方法

1.1材料51例人脑胶质瘤石蜡包埋组织标本由广州军区广州`总医院病理科提供。

1.2仪器与试剂石蜡切片机(MICROM),Nan。drop2000紫外分光光度计(Thermo),Rotor￡ene∞00分析仪(QIA-GEN,德国),Type-⒒HRM PCR K⒒(QIAGEN),QIAamp石蜡组织DNA提取试剂盒(QIAGEN,堡C号:56404)。

1.3引物的设计与合成引彩″ID⒑-F(5′-3′)TGCAGTGGGACCACTATTAT C(21bp);JDI~9-R(5′-3′)CTTGACACCACTGCCATC(18bp)由北京六合华大基因科技股份有限公司合成,使用前以无菌水将引物浓度调至为10um。l/L。1.4基因组DNA提取用石蜡切片机将石蜡包埋组织标本切成5um厚的切片,弃掉暴露在空气中的前几张切片,收集3张组织切片至1,5mlEP管中,用QIAamp石蜡组织DNA提取试剂盒(QIAGEN,货号:56404)提取51例石蜡切片的DNA,具体步骤按照试剂盒说明书进行。然后用Nanodrop2000紫外分光光度计检测DNA浓度,并用ATE缓冲液稀释至30mg/L.

1.5 rD昭基因的PCR扩增与测序PCR反应体系组成:2×HRM PCR Master Mk缓冲液10u1,引物JDI~9-F禾口JD”-R各0.4ul,模板DNA 1·5淤,RNase击ee水7.7△l。设定PCR反应条件%℃预变性10血n,%℃变性⒛s,51℃退火⒛s,延伸⒛s,共硐个循环,进行PCR。所有标本在北京六合华大基因公司测序,确定野生型和突变型。

1.6 PCR反应条件和体系的优化用Deqi胛+Expelt软件,以模板DNA、引物、M匪12以及退火温度为实验因素进行四因素五水平的响应面实验,结合扩增曲线,熔解曲线得到最佳反应条件。

1.7灵敏度检测将JDf~9突变型DNA与野生型DNA统一稀释至⒛mg/L,将突变型和野生型DNA混合进行梯度稀释,突变基因比例依次为100%、50%、犭%、⒓,5%、6%、3%、1%,按照优化的qPCR-HRM反应体系进行扩增。HRM软件分析突变检出范围,即灵敏度。

1.8 HRM方法的重复性

1.8.1批内差异用胶质瘤临床石蜡切片JD”野生型和JDJJ,突变型做模板进行HRM检测,用优化的条件,每份样品重复测定15次

1,8.2批间差异对2例JDH~9突变型和3例野生型胶质瘤组织的DNA进行qPCR-HRM检测,用优化的条件每30d检测一次,共检测4次。

1.9 HRNI分析检测基因突变用优化的qPCR-HRM反应体系和反应条件对51例标本进行PCR扩增并分析熔解曲线,PCR反应条件为%℃预变性10湘h;9~s℃变性⒛s,退火⒛s,72℃延伸20s;50个循环;HRM虻ep6~”℃01℃//9s。用IEl25∝86的DNA做fDJr~9野生标准品,HRM方法分析检测51例胶质瘤病人石蜡标本的DNA是否为JD彬突变,并进行直接测序验证。

2结果分析

2.1人脑胶质瘤组织标本IDIIz基因测序结果其中2例为突变型(ATG)AGG),锶例为野生型见图1。

2.2响应面实验

2.2,1实验设计根据前期大量的优化实验经验总结设定引物,模板,Mg2+以及退火温度区间,用De“gn+Exp甜软件进行响应面设计各因素编码以及水平如表1、表2。

2,2.2结果分析上机进行荧光定量PC艮HRM得到扩增曲线图和熔解曲线图,如图2。自动设定阈值得出CT值。响应面实验得出的参差的正态概率分布图如图3,各个点基本上在一条直线上,说明结果较好。响应面相互作用图如图4,图4a分析可知当同样的引物浓度时,随着模板量的增加CT值呈下降趋势,当模板量固定时,随引物浓度增加CT值呈上升趋势,趋势较模板量的大,所以模板量对CT值影响较引物浓度大,为主效应因子。由图4可得Mg2+与模板量的影响相差不大;图4c中退火温度与Mg2+相比,退火温度为主效应因子。从图4整体来看,交互作用面几乎为零,等高线几乎为直线,即说明四因素之间交互作用不显著。综合分析得出结论为退火温度对于CT值的影响最大。响应面分析选出的最优组合为引物0,6umol/L,模板量59.呖吧,Mg2+浓度2,21mmol/L,退火温度弘℃。再结合扩增曲线以及熔解曲线选出在最优组合相似度较高的四组:第6、16、30组。发现第6组合荧光值很低。第”组合荧光值最高,曲线基线平稳,但是在主峰之前出现明显的次峰,这说明有引物二聚体,引物浓度过高;第30组合熔解曲线单一而陡峭且无杂峰,但是扩增曲线极限较高,即模板量偏高。综合四组考虑第16组合为最佳,扩增曲线基线平稳,荧光值高,CT值为“8(扩增效率高),熔解曲线单一陡峭且无杂峰。

2.3灵敏度检测结果显示HRM法的最低检出限为1%,即突变等位基因比例只有1%时,能检测出突变,见图5。直接测序法结果是突变等位基因浓度为笏%及以上时能检测出突变,12.5%时测序为野生型(纯种突变细胞株),因IElH2突变细胞株未见报道,所以采用石蜡切片中提取的DNA,突变细胞比例比较小,实为混合型DNA,当用野生型石蜡切DNA与突变型的混合后,突变细胞的比例更小,实验中90%,SO%,90%,∞%,乃%的比例,未检测出突变,说明HRM方法比直接测序法灵敏度高。

2.4 HRbI方法的重复性241批内差异用ID25““野生型做野生标准对照,HRM重复检测结果为15份IIl250686为rElH~9野生型,15份IEl299064为JD”突变型,批内重复性好,如图6所示。

2,4,2批间差异由图7可见分别对5例胶质瘤临床样本IDm基因用3个不同时间进行HRM分析检测,结果显示3例野生型和2例突变型检测结果一致,批间重复性高。

2.5 HRbI分析检测基因突变以IIl犭““为野生标准品,HRM分析检测51例标本,其中⒆例为野生型,2例为JD”突变型,与直接测序法结果一致(图8)。3讨论目前关于JDIr~9基因的研究很少,优化参数、方法建立、灵敏度对比以及稳定性评估国内外仍未有报道,IDH2突变检测应用于临床可以预测胶质瘤患者的预后中值`总体生存期,有文献报道有IElH2突变的患者有明显的预后生存期延长,且年轻患者比例高于年老患者。本研究检测IDH2突变采用HRM分析方法,HRM是在实时荧光定量基础上通过饱和荧光染料监控核酸的熔解曲线变化进行分析的技术到,受反应体系和反应条件的影响。本研究利用Deql+e1t软件进行响应面分析,既考虑单因素对结果的影响同时也考虑互作效应[9],比正交试验更有说服力,在大量优化实验的基础上,设定了因素区间,通过四因素五水平的30个实验,随后进行荧光定量PC艮HRM,得到扩增曲线和熔解曲线图,自动设定阈值得到CT值,D雨胛+ExpⅢ软件通过分析选出最佳组合,再结合扩增曲线和熔解曲线得出实际最优条件,灵敏度为1%比传统的直接测序法乃%要小得多,而本研究中直接测序法用突变型浓度为90%,gO%,⒛%,ω%,50%,笏%进行PCR后测序,结果显示均为野生型,分析原因,传统测序法乃%的数据是用纯种突变型细胞株直接提取的DNA,而目前IDH2突变型细胞株至今未见报道,本研究采用石蜡标本提取的DNA,突变细胞的比例会比较小,提取的DNA其实是混合型的DNA,当突变型石蜡标本DNA用野生型石蜡标本DNA进行浓度稀释时检测不出来亦属正常,当如此小比例的突变型DNA用HRM方法检测出来,更说明HRM方法灵敏度很高。批内批间差检测结果说明,此方法重复性好.由于加样误差和机械误差可能会导致曲线的差异,但结果中与野生标准型相比较vah血on比率还是位于同样的突变区间或野生区间的。用优化的条件检测51例胶质瘤病人的DNA,⒆例是野生型,2例是JDlf,突变型,与直接测序法结论一致,说明方法可行,文中给出野生/突变型熔解曲线差异,是HRM方法中差异显示的有力证据,扩增曲线只是说明扩增的效率和荧*值,在优化实验中用于优化条件的直观对比,用优化的条件下进行扩增,不论是野生型还是突变型扩增曲线是没有什么差异的,对于碱基位点变化并不能显示出来,所以在检测突变时给扩增曲线结果是无意义的。最新研究表明,IDH2突变发生于乃3突变和1p19q缺失这些分子事件之前,说明IIlH2突变在胶质瘤发生早期起着重要的作用[20],可能会引起前神经元细胞更易分化为向胶质瘤细胞,少突胶质细胞。在不同级别的胶质瘤中IDH突变率不同说明它们可能来自于不同的祖细胞亚群或者同一种祖细胞亚群通过分化机制不同[加:。由于rDIf9在早期胶质瘤中较多发生,且定位在R172位点,因此可作为一个诊断标志物行遗传筛查,JDJJ,还有望成为一些新药开发的潜在靶点。总之,关于IDH的许多问题尚待进一步研究,如为何突变位点具有特异性,为何突变多发生在胶质瘤和血液病,而在乳腺癌及肺癌等肿瘤中暂未发现突变等等。作为首先从人的肿瘤基因组测序中鉴定的肿瘤发生相关基因,其应用潜力之大,势将进一步推进肿瘤基因组的深人研究以鉴定更多类似的基因突变,这些都将使肿瘤治疗产生本质性的飞跃。致谢感谢我的导师王捷教授对我的悉心指导,感谢广州军区总医院医学实验科提供的经费支持与先进的实验条件,感谢医学实验科其他领导与病理科主任陈晓东的大力支持!

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