均相时间分辨荧光(HTRF)法测定重组单抗含量

重组单克隆抗体药物,因其具有专一性强、副作用小、疗效显著等特点,已经成为近年来研究的热点药物之一[1]。而单克隆抗体的含量测定在细胞株筛选、工艺研究和产品质量控制中都有着重要作用,因此开发一种快速、准确、高通量的测定法对于单克隆抗体药物的开发具有重要意义。单克隆抗体含量测定有较多方法,如消光系数法、HPLC法、ELISA法等[24]。但由于细胞筛选及工艺研究样品的纯度较低、干扰物质多等原因,限制了许多方法的应用.目前此阶段常用的方法是ELISA法,但该法操作繁琐、费时、通量不高,因此有必要开发一种快速、简便、易于自动化和微量化的测定法以满足工艺研究需要。均相时间分辨荧光(HTRF)是近年来发展起来的一种可用于检测纯液相体系中受体与配体结合的新技术,是指在溶液中供体荧光团和受体荧光团距离足够近时(受体与配体或抗体与抗原结合),光子能从受激发的供体荧光团转移到受体荧光团,继而激发受体荧光团使其发出荧光。该技术结合了荧光共振能量转移(FRET)和时间分辨荧光(TRF)两种技术,这种结合将TRF的低背景特点和FRET的均相实验方式融合在一起,使得HTRF技术拥有实验方式灵活、可靠,并且具有更高的灵敏度、更大的通量,实验结果的假阳性率较低等优势。本研究旨在基于HTRF技术建立一种快速、简便、测定重组单克隆抗体含量的分析方法。

1材料与方法

1.1材料Eu3+anu l△uman坨G(Fc)为PerkinElmer公司产品、hghtningˉLink APC Kit为INN0ⅤA公司产品、TNFα为上海普欣生物技术有限公司产品、重组抗TNFα单克隆抗体为珠海市丽珠单抗生物技术有限公司自制、%well plate(Black)为Co哎盯公司产品;其他试剂为进口或国产分析纯。1.2方法1,2.I TNFα~APCⅩL的标记按照LightningˉLink APC K⒒说明书进行。吸取1淤LL mo山丘er reagent至10淤(1mg/lnl)的抗体溶液中,混匀;将此混合液转移至h驷ning乇illk mix中,混匀;室温下静置4h;加入1淤LL-quellcher reagent,混匀;室温静置30min后即可。

1,2,2检测步骤用PBST(10mm。l/L磷酸盐缓冲液,0。“%T,sTeen⒛,pH7,4)将单抗标准品(抗TNFα单克隆抗体)溶液(2⒛mg/lall)稀释至11OO ng/ml,再进行17倍比稀释,共制各9个浓度(1100、“7.1、3gO。6、2

,9、1317、775、456、268和158ng/ml);在%well plate(Black)中,先加人⒛0ng/ml的TNFα-APCⅩL,~DÔ淤/孔;再加人稀释好的标准品、待测样品溶液及质控品溶液,⒛ul/孔,阴性对照孔中加人PB田。加样后置于乃℃恒温箱中振荡孵育1h;再加人⒛0ng/lli Eu3+anti¨human IgG(Fc),50ul/孑L,于犭℃恒温箱中振荡孵育30min后读数,设置激发波长mO nm,在发射波长ω0nm和甾5nm处读取荧光值;读取荧光信号值后,用软件进行分析,以Ddta F值为纵坐标,以单抗浓度的对数值为横坐标绘制四参数拟合曲线。根据四参数方程计算出待测样品中单抗的含量。123方法验证按照《生物制品质量控制分析方法验证技术审评一般原则》(GPⅢ-1),验证方法的专属性、准确性、精密度、线性和范围。专属性是指方法的特异性;准确性是指测定值与真实值之间的一致性或接近程度,一般用回收率表示;精密度是指均质供试品多次取样进行一系列检测结果的接近程度,一般表示为变异系数(C%),变异系数即测定值的标准差和均值的比值;线性是指在给定的范围内检测结果与供试品中被分析物的比例关系;范围是指能达到一定的准确性、精密度和线性时被分析物的较高和较低浓度(量)的一个区间。(1)方法的专属性按照制各标准品的方法制各以下2种样品:RlttI妯mab(重组抗CD⒛单抗,Rocl△e)和Human IgG(Jaclbon),按检测步骤进行实验。(2)方法的准确性与精密度制备不同浓度(1000、80O、5OO、200、1OO、D、乃ng/rlll)的样品,分别于不同日进行测定,每一浓度进行3次重复实验,统计回收率及其变异系数。(3)方法的线性与范围根据准确性结果,以单抗的理论浓度为横坐标,以实际测得的浓度为纵坐标,进行线性拟合;根据准确性、精密度和线性的结果确定方法测定的有效范围。

1.2.4细胞发酵液对测定结果的影响用培养15天的细胞发酵液(此发酵液为本单位培养的另外一种针对不同靶点的单克隆抗体的细胞表达,其培养条件与抗TNFα单抗基本一致)稀释抗TNFα单抗标准品至浓度为1mg/l.ll和0.5mg/Illl。再用PB田稀释以上2个浓度的样品至浓度为⒛01·g/ml和100ng/ml。测定回收率,每一浓度重复2次。

2结果

2.1方法的专属性图1的结果表明,检测试剂只与抗TNFα单抗发生反应,并呈浓度相关,不与抗CD20单抗及Human IgG反应,专属性强。

2.2方法的准确性与精密度表1的结果显示,单抗浓度在z~s~1000ng/ml时,回收率范围为呢8%~1036%,总回收率为989%;变异系数范围为0.2%~Ⅱ6%,总变异系数为43%,符合方法学验证要求。

2.3方法的线性与范围

2.3.1标准品的四参数拟合曲线梯度稀释的单抗,其浓度的对数值与荧光信号的四参数拟合曲线呈S型,相关系数0∞以上,结果见图2。

2.3.2理论值与实测值线性分析将表1中单抗浓度的理论值与实际测定值的平均值做线性分析。结果表明,单抗浓度在乃~1000ng/ml之间时,理论浓度与实测浓度线性良好,相关系数以上,结果见图3。

2.3.3方法的测定范围根据方法的准确性、精密度及线性的结果,在上述检测条件下,重组抗TNFα单抗浓度的测定范围为乃~1000ng/ml。

2.4细胞发酵液对测定结果的影响表2的结果显示,细胞发酵液对测定结果基本无影响

3讨论

荧光共振能量转移(FRET)是指电子激发能在适当的能量供体和能量受体之间传递。当一个荧光分子(又称为供体分子)的荧光光谱与另一个荧光分子(又称为受体分子)的激发光谱相重叠时,供体荧光分子的激发能诱发受体分子发出荧光,同时供体荧光分子自身的荧光强度衰减,这种现象称为荧光共振能量转移[:]。FRET的发生与供、受体分子的空间距离紧密相关,一般为7~10nm时即可发生FRET,随着距离延长,FRET呈显著减弱趋势。传统FRET使用的供体和受体是快速荧光基团,半衰期非常短。其限制因素是由背景荧光引起的,这些背景荧光来自样品成分,包括缓冲液、蛋白质、化合物和细胞裂解液等[9]。检测到的荧光强度必须对这些自发荧光进行校正,极大地影响了实验灵敏度,并使数据分析变得复杂。背景荧光非常短暂,可以利用时间分辨荧光(TRF)方法将其去除,即所谓TR-FRET技术。时间分辨荧光(TRF)利用了稀土元素中镧系元素的独特性质。常用的镧系元素是铕(Eu)和铽(Tb)。与传统荧光基团相比,它们具有大的斯托克斯位移(最大荧光波长与最大吸收波长之间的差)和非常长的发射半衰期(从微秒到毫秒)。使用这种长寿命的荧光基团结合荧光分辨的分析方式(在荧光激发和发射检测之间有一个时间延迟)可将背景荧光的干扰有效降低。一般TR FRET是将镧系元素与有机分子形成螯合物(Chelate),作为能量供体,但其稳定性较差,而且有的化合物可竞争螯合物活性基团。HTRF也是基于TR-FRET技术,所不同的是它将镧系元素与一种络合的穴状化合物(CllTptate)结合,这种结合的穴状物与其它所有TR-FRET产品使用的螯合物相比,显著增加了稳定性(可耐受低pH值、金属离子、DMsO、EDTA等)。对于重组单克隆抗体含量测定,该法只需简单标记其对应的抗原,将抗体、标记的抗原及镧系元素(如Eu)标记的抗人坨G(Fc)加人%孔板中孵育后即可检测,操作步骤相对简单;HTRF法具有与ELISA同等的检测范围和检测极限,但它不需要提前包被、封闭和洗板等诸多环节,可以极大地减少实验所需时间。另外,因为反应是在溶液中进行,不存在清洗过程等干扰,可以很大程度反映抗原与抗体的结合情况,尤其是在细胞株筛选过程中,比起ELISA法可以更真实地反映抗体的亲和力。本研究建立的重组单抗含量测定方法,专属性好,准确度、精密度和线性皆满足测定的要求,可以用于细胞培养液及纯化产物中抗体含量的测定,也可以为其他单克隆抗体含量测定方法的建立提供参考。

参考文献

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