利用N-糖基化修饰对β-甘露聚糖酶Man47的稳定性改造

β-甘露聚糖酶广泛存在于自然界中,在动物(海洋动物:l])、发芽植物的种子中(如番茄、咖啡豆、瓜儿豆、魔芋、四棱豆等[25])和微生物(包括细菌、真菌和放线菌)中都有所发现,其中微生物是β-甘露聚糖酶的主要来源。Β-甘露聚糖酶在食品、医药、造纸、饲料和石油等工业中有广泛的应用。考虑到动物摄食、营养和饲料加工等过程的特殊要求,饲用甘露聚糖酶需具各一定的特殊性,如:良好温度稳定性,能够经受高温制粒的加工后在常温下仍具有高酶活;广谱的pH稳定性,一般动物消化道的不同位置酸碱环境不同,pH值在2.5~6.8左右,因此饲用甘露聚糖酶需要在酸性环境下保持稳定同时还需要在酸性和中性的条件下维持较高活性;另外,由于动物消化道内具有各种消化酶,因此甘露聚糖酶还需要具有一定的消化酶抗性。通过分子改良来获得具有优良性质的甘露聚糖酶成为目前备受关注的研究热点之一。

本研究以β-甘露聚糖酶MAN47[:]为研究对象,利用生物信息学对β-甘露聚糖酶MAM7进行理性设计,定向地引入N-糖基化位点,利用糖链的亲水性、体积效应、屏蔽蛋白酶作用位点等特性以及糖链与蛋白质之间的相互作用,增加蛋白质的刚性等,达到对β-甘露聚糖酶MAM7的稳定性改造,以获得具有优良稳定性的β-甘露聚糖酶MAN47突变体,并探讨建立蛋白质理性糖基化改造的技术方法。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1菌株和质粒大肠杆菌DH5α菌株由本实验室保存,毕赤酵母SMD1168购自In诫rc,gen公司,质粒PB由本研究所自行构建。

1.1.2酶和试剂PCR所用的试剂购自TOYOBO公司;限制性内切酶屁X3色I购自公司;⒎连接酶购自NEB公司;质粒抽提试剂盒和DNA片段回收试剂盒购目北京百泰克公司;引物合成及测序由上海生物工程公司完成。槐豆胶G Cl753和甘露糖M-ω20、胰蛋白酶弘799-10G、胃蛋白酶″000均购自⒌gma公司,其他化学试剂为国产或进口分析纯。

1.1.3培养基大肠杆菌培养基LB,参照分子克隆实验指南配制。酵母生长培养基YPG、转化培养基MD、诱导表达培养基BMGY和BMMY均根据In砬"gen公司操作手册配制。

1.2方法

1.2.1β¨甘露聚糖酶的同源模建通过中PDBJ⒚5数据库进行模板搜索,得到与β-甘露聚糖酶Mal1o7同源性最高的序列木霉属β-甘露聚糖酶(PDB II|:1qIlr),从PDB数据库下载该三维结构;接着利用DS30中的MODELER模块构建目标序列的3D模型;并对模型进行优化,包括Loop区优化、加氢优化和侧链优化,每一次优化之后分别使用Ramachandran plot对模型进行评估,最后获得Mal1o7最合理的三维模型。

1.2.2最佳突变体的确定在不改变β-甘露聚糖酶原有的催化活性以及其他性质的前提下,利用DS3,0和αyPr。t软件,对其分别进行了Loop区分析、活性中心分析、空间位点分析和EAS(enhanced aroma⒒c sequence)序列分析,最终优选出预测的突变体gˉ123,然后进行重组表达。

1.2.3重组表达载体的构建利用合成生物学方法构建Mal1o7及其突变体引23的生物部件,将其亚克隆至载体框架PB(此部分内容将另文发表),并按标准组装方法[9]构建MallH7及其突变体⒏123的毕赤酵母重组表达载体(图1)。根据Mal1o7及突变体⒏123基因序列设计引物,上游引物引人EcoR I和肋@I酶切位点,下游引物引入助eI和凡矽I酶切位点。引物如下:MallH7-F5′-GⅢTC TTCGAATTCGCGGCCGCmCTAGAcACCACCACCACCA CCACGCTGTTCCTGAGTGGGGCCAATG名′,Mal107-R:5′-GTTTCTTCCTGCAGCGGCCGCTACTAGTCTAGTGGTG GTGGTGGTGGTGCGCCCGCGC1门rrcAATGTAAC-3′;突变引杉9ⅣI121F/T123N-Fm:5′-ATACTGGGTCGGGTTGT TCGGCAATAGCACTACAGATATG名′;M121F//T123NˉRm:5′-CTGTAGTGCTATTGCCGACAACCCGACCCAGTA T⒍3′;PCR产物酶切后克隆在PB表达载体上,构成重组表达载体PB-Mal107。其中,Pa。x代表AoⅩ启动子,ss1代表的是信号肽α-交配因子的前导序列,Ta。x代表AOⅩ转录终止子,PgHT代表H尢4选择标记基因表达框,Ma鹋7代表βˉ甘露聚糖酶Mall+7基因。

1,2.4毕赤酵母的电转化及筛选按IIlvitrogen公司试剂盒操作手册进行,挑取毕赤酵母SMD1168(Hh,Mtlt+)单菌落接种于51nl YPG液体培养基中,28℃振荡培养过夜;再以01%~05%的比例接种到~0Ôllll YPG液体培养基中,明℃培养过夜,直到@凡00=1·8~2.0,娴00∽llln、4℃条件下离`心5而n,弃去上清;每管用硐1111溶液I(100mm。l/L hAc、10mmol/L DTT、06moL/L山梨醇、10mmol/L⒎is-HαpH7.5)重悬,室温放置30min;40001/血n、4℃条件下离心5汕n,弃去上清;用3,乃m11mol/L山梨醇洗涤3次;用硐0I△l山梨醇重悬细胞,每管gO ul,分装至1,51111EP管;将3~5吧经过线性化了的DNA(溶解在双蒸水中,体积为1~2ul)加人装有gO ul感受态细胞的15nll EP管中,混匀。电击(参数:15kⅤ,5ms)结束后立即加人11111预冷的山梨醇,混匀后以每平板⒛0淤菌液涂布到MD平板上,⒛℃培养2~3d,直到有转化子出现。

1.2.5重组菌的诱导表达重组酵母在51111BMGY培养基中于28℃摇床培养勿h,离心收集菌体,加人5nll BMMY甲醇诱导培养基重悬菌体,羽℃继续培养,”h后取样检测各菌株上清液的甘露聚糖酶活性,从中筛选出表达甘露聚糖酶的阳性转化子。

1.2.6甘露聚糖酶活性的测定[lO]取0,5%的槐豆胶溶液(用pH6,00,∝mol/LN%HP04Cl.⒆mol/L柠檬酸)7⒛淤,加人SO1Ll酶液,振荡混匀,妁℃反应30 min后,加人1.2nll DNS终止反应,100℃显色10min,立即用流动水冷却到室温,10OO01/雨n、离心4耐n,去除絮状物。MO nm处测定吸光度值。先将⒛淤酶液在100℃沸水中煮沸10“n,再加人同体积的底物保温,作为对照。酶活力定义:在pH68,佃℃试验条件下,以每分钟水解底物产生1umol相当于D¨甘露糖的还原糖的酶量定义为1个甘露聚糖酶单位(It/lnl)。

1.2.7温度和pH对突变体酶活力的影响在不同温度(30℃,们℃,D^0℃,ω℃,⒛℃,gO℃)下按常规法测定酶活力,以未处理的原酶液活力为100%,计算各组酶的相对活力。在不同pH(3·0,4.0,50,60,7.0,80,90)缓冲液配置的底物下,按常规法测定酶活pH30~80(02mol/L Na.HPO4Cl1mol/L∶柠檬酸);pH90(0“m。l甘氨酸-NaOH),按常规法测定酶活力,以未处理的原酶液活力为100%,计算各组酶的相对活力。

1.2.8酶的热稳定性和pH稳定性在pH68条件下,将酶液在不同的温度(30℃,娴℃,50℃,ω℃,⒛℃,⒛℃)下温育30mh,按常规法测定酶活力,以未处理的原酶液活力为100%,计算各组酶的相对活力。酶液与上述不同pH(3,0,40,5.0,6,0,7,0,80,90)缓冲液于ω℃,温育30耐n后,按常规法测定酶活力,以未处理的原酶液活力为100%,计算各组酶的相对活力。

1.2.9胰蛋白酶抗性分析[n]分别将粗酶液和胰蛋白酶液(0,1mol/L PBS pH7.0缓冲液)按照w:w为⒈01情况下,37℃温浴处理不同的时间后,计算其残余酶活力,残余酶活力的高低表示目标酶胰蛋白酶抗性的高低。1210胃蛋白酶抗性分析:⒓∶分别将粗酶液和胰蛋白酶液(01md/L甘氨酸-Htl pH20缓冲液)按照w:w为⒈0,1情况下,37℃温浴处理不同的时间后,计算其残余酶活力,残余酶活力的高低表示目标酶胃蛋白酶抗性的高低。

2结果

2.1阡甘露聚糖酶同源模建与最佳突变体的确定用D“,0构建三维模型,利用Ramachandran对模建的Mal1o73D图形进行合理性评价(图2),Ramachandran图形中处于合理区域的氨基酸比例在937%,验证了模型的合理性。接着以甘露四糖作为底物分子进行分子对接,分析Mal1o7催化中心关键氨基酸分子,底物对接的部位位于Mayl+7催化结构域。在配体¨蛋白相互作用二维平面图中,可以直观地观察到两者的相互作用力及关键的氨基酸和基团,结果如图3所示。接着用DS30软件对3D模型进行Loop区分析,构建具有EAS序列的虚拟突变体,利用N-糖基化预测软件GlyPld(http//叩唧,glyc∞c忆Ⅱes。de/glyplc√)进一步预测并筛选得到合适的突变体引23,最后将构建好的⒏123糖基化突变体的3D模型表示出来(图4、图5)。图4中Aqn表示构建的一个N-糖基化位点,位于Mall+7模型中的狃位(同源建模获得的模型Mal1o7是从第90位氨基酸开始,因此预测结果中的“位氨基酸,实际上是序列中的第123位氨基酸)。

2.2重组酵母表达载体PBˉMAN47的构建Malld7基因全长13弱bp,利用重叠延伸PCR的方法,获取全长基因。以引物F和引物Rm为引物,以Mal147pYCα为模板,合成片段1-S;以引物R和引物Fm为引物,以Mall+⒎pYCα为模板,合成片段⒈F(图6a)。最后以上下游片段为模板,扩增全长基因(图6b)。通过酶切鉴定(图6c)和测序后,证实基因以正确的阅读框与酵母表达载体PB的α-因子信号肽序列的3′端融合,得到重组表达载体PB-Mal147。

2.3酶的诱导表达重组载体上带有Jfzs亻基因以及AOⅩ1基因的5′和3′同源序列区,经过乃cI线性化电转化受体菌SMD1168(Jfzs Jrzt扌+)后,只有尻s亻基因整合到酵母染色体上的重组酵母才能在不加H“的培养基MD上正常生长,通过这一标记筛选到Ⅲs+转化子。进一步诱导表达,通过酶活性测定,筛选表达甘露聚糖酶的重组子,诱导”h后,表达量达到0.⒛m酽ml。三氯乙酸(TCA)沉淀法浓缩培养上清中的蛋白,15%SDS-PAGE分析,突变体引23和野生型蛋白均得到表达(图7)。根据蛋白分子量的对数与蛋白质的迁移率成正比的关系,与对照组(野生型Mal1o7分子量为弱kDa)比较,⒏1⒛突变体泳道上在分子量为0~skDa左右的位置上出现了两条比较明显的蛋白带,此应为⒏123突变体不同程度糖基化的重组蛋白。

2.4酶学性质分析

2.4.1最适温度和温度稳定性突变体⒏123和野生型的最适温度均为ω℃(图8a),在⒛℃时,野生型的相对酶活下降到21,4%,而⒏123相对酶活力保持在53,4%,在其他温度下两者的相对酶活力接近;在30~50℃的范围内(图8b),两者都较稳定;在∞~gO℃的范围内,突变酶的稳定性较野生型好,说明突变酶的耐热性优于野生型。

2.4.2最适pH和pH稳定性突变酶和野生型酶的最适pH均为60(图9a),说明突变前后目标酶催化反应的最适pH并没有发生改变,在pH40~80的范围内,野生型酶与突变酶的相对酶活力基本一致,在pH3.0和pH90突变酶的相对酶活力分别是野生型的13倍和1.5倍c突变体和野生型酶pH的稳定性比较(图9b),酶活力残留50%以上时,突变酶的pH范围为pH40~80,而野生型酶的pH范围为pH4.8~75c突变体酶的酸碱稳定范围得到一定的拓宽。

2.5蛋白酶抗性

2.5.1胃蛋白酶抗性pH20的甘氨酸-HCl缓冲液配成人工模拟的胃蛋白酶液,37℃消化不同时间后,突变酶在各个时间点的残余酶活力均比野生型高(图10a).通过计算可知:野生型的半衰期为72min,突变酶为210血n,其半衰期是野生型的2,9倍。说明突变体耐受胃蛋白酶消化的能力较野生型的强。

2.5.2胰蛋白酶抗性pH70的PBS缓冲液配成人工模拟的胰蛋白酶液,37℃消化不同时间后,突变酶在各个时间点的残余酶活力均比野生型略高(图10b)。通过计算可知:野生型的半衰期为282mh,突变酶为3721111n,其半衰期是野生型的1,3倍。说明突变体耐受胰蛋白酶消化的能力与野生型的相比提高不明显,这可能是因为该野生型是已经进行过胰蛋白酶抗性改造的,已经具各有一定的胰蛋白酶抗性,继续提高抗性不明显。

3讨论

对蛋白质进行人工糖基化改性属于蛋白质糖基化工程的研究内容。所谓蛋白质糖基化工程,就是通过对蛋白质表面的糖链进行改造,从而改良蛋白质性质的一种技术.常用的对糖链进行改造的方法有:(1)通过定点突变技术增加或减少蛋白质的糖基化位点,从而增加或减少蛋白质表面的糖链;(2)在体外通过化学或酶法[1b]对糖链进行修饰;(3)细胞内由一系列糖苷酶和糖基转移酶组装成糖基化途径来催化蛋白质的糖基化。通过基因工程手段改变宿主细胞内糖基化途径中糖苷酶和糖基转移酶的表达,即可改变在该系统中表达的糖蛋白的糖基化形式。通过糖基化可增加蛋白质对于各种变性条件(如变性剂、热等)的稳定性,防止蛋白质的相互聚集[18]。同时,蛋白质表面的糖链还可覆盖蛋白质分子中的某些蛋白酶降解位点,从而增加蛋白质对于蛋白酶的抗性[19]。然而反复的实验证明随机地引人N-糖基化位点,常常会引起蛋白质热稳定性下降。2011年据文献[2021]报道蛋白质分子内的EAS序列,X是除Ro氨酸以外的其他氨基酸)中的Phe,Thr分别同热n上连接的乙酰葡萄糖胺相互作用,形成疏水核心,从而可以增加蛋白质稳定。本研究以A,莎@3esce刀sβ-甘露聚糖酶Ma鹋7为研究对象,在尽可能不改变酶分子间构象,不破坏酶活性中心的前提下,在肽段的合适位置构建了具有EAS序列的突变体,并优选出了引23位点为最佳的N-糖基化位点的突变体(Plle121-Gly122-Asn123-ser124-Thr125)。通过引入的糖链所带来的亲水性,体积效应,屏蔽蛋白酶作用位点等及糖链与蛋白质之间的相互作用力,增加甘露聚糖酶分子的刚性,从而获得稳定性增强的糖基化修饰的β-甘露聚糖酶MallH7。本实验中通过定点突变技术,构建具有EAS序列的突变体,并将其导人到巴斯德毕赤酵母进行N-糖基化的诱导表达,最终获得了具有N-糖链的糖蛋白突变体123.通过酶学性质分析和蛋白酶抗性分析发现:护⒛在耐碱能力、耐高温处理以及抵抗蛋白酶消化方面,较野生型而言,均得到了改善。具有多重稳定性的酶分子,在实际应用中具有更广阔的前景,本研究为通过理性设计的糖基化修饰对酶分子稳定性改良提供了新的思路和经验。

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