温和破壁制备酵母源生物蛋白的研究

如何有效全面地利用酵母所含的营养物质,长期以来一直是学者们关注的方向。酵母含有丰富的蛋白质,可高达60%,含有18种以上的氨基酸,其中赖氨酸、含硫氨基酸、苏氨酸、色氨酸含量都达到国际粮农组织和世界卫生组织推荐优质蛋白∷的标准。同时富含B族维生素及矿物质,低脂,低糖,不含胆固醇,还含有丰富的酶系及多种经济价值很高的生理活性物质,生物利用度高。具有天然安全、质量稳定、可规模化生产的特点。在人类健康食品和动物养殖领域具有巨大的开发潜力。但酵母细胞壁结构坚韧,含有不能被消化酶切断的化学键,酵母细胞内营养物质和生理活性物质难被肠道高效吸收利用,不少有效成分作为废弃物被排出体外。酸碱处理法、高压匀浆法、外加酶法是目前国内外常见的、可产业化的破壁方法,它们在破壁的过程中都会不同程度造成酵母胞内营养成分破坏、活性物质失效,产品口感苦涩等等问题[I]。酸碱法对营养物的破坏较大,还存在有害物质三氯丙醇等问题;高压匀浆法其机械剪切力及热效应可对胞内高活性物质造成部分不可逆的损伤,从而降低营养价值;夕卜酶法,虽然温和,但产品风味及营养结构变化较大,也增加了生产成本;另外,一般自溶法也可以温和破壁,但破壁效果较差。研究温和有效的破壁技术,对开发酵母源优质生物蛋白具有重要意义。

1材料与方法

1.1材料新鲜酵母乳液及葡聚糖酶(广东江门生物技术开发中心有限公司提供),木瓜蛋白酶(广西庞博公司提供)。

1.2仪器设备KDN~102c自动定氮仪(上海纤检仪器有限公司);FE-20酸度计(梅特勒-托利多公司);MⅩ-50水分测定仪(日本AND公司);LC-6M冷冻离心机(上海离心机械研究所);SHA-B恒温振荡水浴锅(江苏金坛亿通电子有限公司);11OO型液相色谱仪(美国安捷伦公司);TAs9⒛型原子吸收分光光度计(北京普析通用仪器有限责任公司);RE⒛⒆旋转蒸发仪(上海博彩仪器设各有限公司);DLP实验型喷雾干燥机(江苏星轮高速机电设各制造公司)。

1.3检测方法

1.3.1酵母浓度分析用水分测定仪测定。

1.3,2蛋白质含量分析用凯氏定氮法测定[2]。

1.3.3氨基酸组分分析氨基酸含量的组成分析采用《实用食品营养成分分析手册》中游离氨基酸的测定方法[3],含量测定计量单位为酽100g。

1.3.4氨基氮含量分析甲醛滴定法[3]分析测定。

1.3.5钙含量、锌含量分析用原子吸收分光光度法[4]。

1.36硒含量分析原子荧光光谱法。

1.3.7还原型谷胱甘肽含量分析在原四氧嘧啶法[6]基础上,采用温差破碎酵母细胞,使得酵母中的蛋白质以沉淀形式除去,测定离心上清液中的还原型谷胱甘肽(GsH)含量。

1.3.8海藻糖分析蒽酮-硫酸法[7]。

1.3.9酵母破壁效果鉴于目前国内常用的破壁效果评价方法无法定量衡量胞内物质的析出程度,难以判断析出物在消化吸收过程中的可利用性。为更科学有效地评价酵母破壁效果,本试验以蛋白质释放率作为定量评价酵母破壁效果的衡量标准。该法采用双联检测法——能反映蛋白质肽键的Low叮法和反映含氮总量的定氮法[2],样品处理考虑模拟人体胃液消化环境,测定值可有效体现酵母破壁后可利用性的蛋白质在酵母总蛋白中的比例。

1.4建立温和有效的破壁法据研究发现,在酵母的自溶过程中,起重要作用的是蛋白酶,主要有A、B、C、D4种。其中,A酶是外切肽酶,最适作用温度为30℃~35℃;B、C、D酶都是内切肽酶,其中B、C酶的最适作用温度为50℃左右,D酶的最适作用温度为∞℃左右[9]。因此,采用不同的温度与作用时间,有利于提高与自溶密切相关的4种蛋白酶的活性,缩短自溶过程。葡聚糖对支持酵母壁的结构有着举足轻重的作用。据Masah沅等[lO]研究发现,酵母自溶现象与细胞壁代谢之间存在密切的关系。尤其在pH5.0时,酵母细胞壁多聚糖表现出较强水解作用:位于细胞质膜内侧的葡聚糖酶作用于细胞壁葡聚糖,使得酵母细胞壁结构松散从而增大通透性,促使生成物溶出。因此,采用不同的温度与作用时间可在激活蛋白酶同时也促进自身葡聚糖酶的作用。但酵母自身所固有的引发自溶的酶类激活是缓慢的,维持酶活力时间也较短[11]。同时,酵母中的糖元分解成单糖和低糖,蛋白质分解成肽类和氨基酸,由于美拉德反应等复杂过程的综合作用,酵母自溶液的色泽会发生褐化,最后导致产品色泽和风味的变化[⒓]。由此,我们建立了一种温和有效的破壁技术,以自溶法为主,采用三段变温工艺激活酵母的蛋白酶、葡聚糖酶等自身酶系。为进一步增强破壁效果,控制美拉德及其它反应的产生,降低对产品的风味及营养成分的影响,我们没有选择外加蛋白酶,仅加人适量的葡聚糖酶来强化破壁。通过正交法确定基础工艺条件;通过蛋白质释放率考察破壁程度;通过还原型谷胱甘肽、海藻糖、蛋白质、游离氨基酸、氨基氮及部分矿物质含量,产品风味、颜色等指标来综合评价营养物质保全状况;通过动物饲养应用效果辅助评价破壁酵母的营养物应用价值。

2结果与讨论

2.1自溶破璧基础条件研究为研究在模拟酵母胞内自溶条件的试验中各因素及因素间协同作用的最佳方案,分别对温度、pH、酵母细胞浓度及反应时间取合理的3个水平,以蛋白质释放率作为分析指标,按正交试验表L9(34)进行正交试验,结果见表1、表2。从表1、表2可知,对酵母破壁的影响因素依次为温度)pH)细胞浓度)时间。这可能是由于酵母内源蛋白酶的最适作用温度范围在35~60℃左右[9],尤其在~sO~∞℃时,内源酶处于高活性状态,可将酵母细胞壁中与甘露聚糖、葡聚糖紧密交联的蛋白质分子层解离,从而破除酵母细胞壁结构,使胞内营养物质更好地释放于胞外。另外,酵母内源酶最适pH范围较广,因此在pH值为5,0~7.0之间时,对酵母破壁起最主要作用的是温度。由正交试验可知,当pH6,0,温度60℃,细胞浓度11%,作用16h时,酵母破壁效果最好.

 2.2三段变温自溶加酶法的破壁研究在上述研究基础上,为更好激活多种自溶酶,强化破壁效果,同时控制蛋白质及多糖的水解与反应程度,在破壁的同时尽量保全营养物质,我们设计了三段变温自溶加酶法,即选用细胞浓度11%的新鲜酵母乳经40℃处理4h,添加1%口葡聚糖酶55℃处理4h,再经60℃处理4h。现将三段变温自溶加酶法与变温自溶法、恒温自溶法的破壁效果进行对比,结果见图1和表3。由图1及表3可以看出:(1)三种自溶法均具有破壁效果;(2)从蛋白质释放率数据分析,三段变温自溶法比恒温自溶法的破壁效果要好,能更好激活自身酶系进行破壁,且可缩短处理时间4h;(3)三段变温加酶法的蛋白质释放率比三段变温法高,说明通过加入与细胞壁破壁有关的葡聚糖酶,可以起到强化破壁的作用.

2.3温和破壁酵母营养保全分析为考察破壁过程酵母营养成分保全情况,选用了相对比较温和的外酶法试制了对比样品,即取细胞浓度11%的新鲜酵母乳,添加1%@木瓜蛋白酶及1‰葡聚糖酶,pH60,60℃处理12h。将未处理酵母粉、外酶法和三段变温自溶加酶法所制得的酵母产品内的蛋白质、氨基酸、矿物质、还原型谷胱甘肽、海藻糖、风味、颜色从表4可知,采用三段变温自溶加酶技术制备的破壁酵母营养物质保全良好。三段变温自溶加酶法与外酶法相比:⑴氨基氮及游离氨基酸变化率小,说明蛋白质被水解程度更小;⑵颜色加深不明显,显示降解的糖及氨基酸进行美拉德反应程度较小;⑶蛋白质、还原型谷胱甘肽及钙、锌、硒等矿物质含量变化率不大,海藻糖有一定增加,说明营养物质保全状况良好;⑷风味及口感更好,且保留了部分酵母香味,更利于应用推广。综合上述图1、表3、表4的结果,三段变温自溶加酶技术,在增强破壁提高蛋白质释放率的同时,酵母细胞内的营养物质保全程度良好,是一种温和有效且易产业化推广的破壁技术。

2.4在动物养殖方面的应用效果观察将本研究所试生产的温和破壁酵母粉在动物营养饲料领域进行了应用效果观察。产品于广东几家猪场进行初步饲养试验,在断奶仔猪的教槽料中添加3%~10%使用,能显著增强诱食性,提高仔猪的日采食量5%~10%,仔猪生长状态良好,成活率提高10%~⒛%,仔猪的免疫能力有所增强,抗生素等药物的使用量下降等。现应用温和破壁技术生产的破壁酵母,已经被多家饲料公司如广东海大集团有限公司下属某饲料厂等试用认可。由此可见,采用温和有效的破壁技术制各的破壁酵母,安全、诱食性好、营养价值高,还可增强免疫力,是一种优质的生物蛋白。

3结束语

与传统破壁方法相比,本研究开发的三段变温自溶加酶技术,破壁效果更好,提高了酵母蛋白质等营养物质的生物利用度。该温和破壁酵母营养物质保全较好,风味良好,易产业化。本研究成果为酵母成为人类健康及动物养殖的高安全、高营养价值的优质生物蛋白源提供了一种较好的解决方案。

参考文献

[1]杨翠竹,李艳,阮南.酵母细胞破壁技术研究与应用进展[J].{H}食品科技,2006,(7):138-142.

[2]黄伟坤.食品分析与检验[M].{H}北京:中国轻工业出版社,1995.

[3]杨月欣,王光亚.实用食物营养成分分析手册[M].{H}北京:中国轻工业出版社,2002.

[4]张国文.原子吸收分光光度计测定食品中微量元素[J].{H}粮油食品科技,2002,(06):34-35.

[5]食品安全国家标准——食品中硒的测定[S].

[6]上海市医学化验所.临床生化检验(上)[M].{H}上海:上海科学技术出版社,1979.

[7]于景芝,陈尧燊,俞学峰.酵母生产与应用手册[M].{H}北京:中国轻工业出版社,2008.

[8]韦平和.生物化学实验与指导[M].{H}北京:中国医药科技出版社,2003.

[9]李祥,彭莉,王毅.酵母自溶研究[J].{H}中国酿造,2001,(5):17-19.

[10]Masahiro Inouhe,Sugo E,Tohoyama H.Cell wall metabolism and autolytic activities of the yeast Saccharomyces exiguus[J].International Joumal of Biological Macromolecules,1997.11-14.