响应面法优化棘孢木霉产厚垣孢子发酵工艺

木霉菌是一种具有重要经济价值的有益菌,主要用于植物病害的生物防治[1],可产生多种拮抗物质,生防机制多样化,在植物病害生物防治中显示出明显的优势。早在⒛世纪⒛年代,人们就认识到木霉菌对植物病原菌的拮抗作用[2],1981年西欧国家已进行木霉菌制剂的商品化生产[3],如今木霉菌作为生物防治微生物已得到广泛应用[4]。

目前我国登记的木霉菌制剂主要为活分生孢子制剂,其货架期较短,在一定程度影响了推广使用;厚垣孢子则具有抗逆性强、存活期长、易贮藏等特点,能够满足生产上的实际需求,可是厚垣孢子培养条件苛刻、产孢数量少。因此,研究高产厚垣孢子的液体发酵条件尤为重要。

对木霉菌厚垣孢子的发酵研究,现在仍集中在单次单因子法和正交试验设计法上,对各因素之间的交互作用考虑较少,无法提供不同因子互作对厚垣孢子产生影响的信息,从而限制了厚垣孢子产量提高的途径[5]。近年来,基于统计学方法的实验设计广泛地应用于化学、化工以及生物方面,其中RSM即响应面法可用较少的实验数据推算出目标值的优化条件,优化效率高叫,其原理是通过一系列确定性试验拟合一个响应面,来模拟真实的极限状态曲面,从而很容易进行可靠性分析,它已广泛地应用于农业、生物、食品、化工等领域的工艺优化设计之中。本研究正是采用响应面法对棘孢木霉生防菌株发酵产厚垣孢子的关键因素进行优化。由前期单因子试验得知:黄豆饼粉-玉米粉用量、甘油添加量、装液量和初始pH对本试验菌株的厚垣孢子产量影响显著,所以,本试验将对此4因素的最佳值进行优化。利用响应面中的Bt,xJellhnken设计设定这4个因素为自变量,以厚垣孢子产量为响应值,通过软件对实验数据进行多项式回归分析,建立多元二次回归方程,并利用方差分析模型和各因子的显著性以期获得木霉菌ZJSX50Os菌株厚垣孢子液体发酵工艺的最佳参数,为木霉菌厚垣孢子菌剂的开发提供参考。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1菌株棘孢木霉ZJSⅩ5003菌株是本实验室分离自浙江省绍兴市蔬菜田土壤中的生防菌株,能够拮抗多种植物病害,尤其是针对黄瓜枯萎病和玉米茎腐病。活体防效分别为85.08%、66.67%,此菌株已申报国家发明专利(公开号CN1∞888350A),用20%甘油保藏于-80℃超低温冰箱。

1.1,2仪器和药品电子天平;ZHWY2112B摇床、ZHJH-1109超净工作台、LRH-150生化培养箱(上海智城分析仪器制造有限公司);生物显微镜(Loca DM2500);pH计(上海精密科学仪器有限公司pHS3C);三角瓶、烧杯、移液枪(BlDoht);血球计数板(上海市求精生化试剂仪器有限公司);微生物发酵罐(YGF10L)。玉米粉、高温黄豆饼粉(上海源叶生物科技有限公司);甘油、HCl、NaOH(国药集团化学试剂有限公司)。

1.2方法

1.2,1菌株活化、接种将保存的棘孢木霉纫SX5003菌株转接到PDA平板上,培养至第3天取其菌落边缘菌丝再次转接到新的PDA平板上,这样连续活化3次,然后培养至第7天,用无菌水将其稀释成浓度为107/ml的孢子悬浮液,按1%的接种量向培养基中接种此分生孢子悬浮液,即每100ml培养基中接人ml1此孢子悬浮液。

1.2.2培养基配制试验中发酵所用培养基的配制是在自来水中加入黄豆饼粉-玉米粉(混合比例为⒉1)和甘油,然后用01m。L/L的Hα与NaoH调节发酵液的初始pH,最后倒人⒛0ml的三角瓶中,置于摇床振荡培养,其中黄豆饼粉-玉米粉和甘油的用量、pH值的调节、三角瓶的装液量都根据表2中的试验设计方案确定,每个处理3个重复,结果取平均值。

1.2.3发酵条件将接种好的三角瓶随机放置到摇床上,摇床转速调为150〃湘n,培养温度采取变温发酵(变温发酵在多领域试验中都有应用且效果满意:前2d为30℃,第3d到第4d为⒛℃,第5d到第8d为⒛℃,光照采用自然光。转速和温度数值的设定根据前期单因素试验所得最佳值确定。

1.2.4 BBD实验设计的因素和水平响应面BBD设计分析模型能用较少的试验次数进行全面的分析研究。根据之前单因素试验结果得知影响棘孢木霉ZJSX5003菌株产厚垣孢子的4个主要因素为黄豆饼粉-玉米粉用量、甘油添加量、装液量和pH值,因此选取此4因素为本试验的自变量,以厚垣孢子产量为响应值进行响应面BBD设计,试验因素、水平值及编码值见表1。

1.2.5厚垣孢子产量测定发酵至第8天时,厚垣孢子基本脱落,将摇瓶取出,把发酵液摇晃均匀后取出1nll稀释10倍,然后将清洁干燥的血球计数板盖上盖玻片,把稀释好的菌液摇匀后用移液枪吸取150淤,将其从盖玻片边缘滴入,静止5而n后,在显微镜下计数。本试验所用血球计数板的计数室为5×5大格,每个大格内为4×4小格,将4个顶角和一个中间大格内的厚垣孢子数之和记下,然后除以5再乘以犭得到此计数室内厚垣孢子个数,另一个计数室也以同样方法计数,取2个计数室内厚垣孢子数的平均数,再乘以I04,得到每毫升菌液中厚垣孢子数,最后乘以稀释倍数10,得到每毫升原始发酵液中厚垣孢子数量。

1.2.6数据分析每组实验重复3次,取平均值,实验结果利用软件中Btlx BelalllcDeqlgn(BBD)模块进行数据建模和分析,并绘制各显著因素对于响应值之间的相互关系的3D响应面和2D等高线图。

1.2.7验证为了验证响应面模型推算得到的最佳发酵工艺的可行性,采用得到的最佳发酵条件进行验证试验。将最佳发酵条件分别应用于3次平行摇瓶试验和IOL发酵罐上,考察响应面模型预测的准确性及最佳发酵工艺在10L发酵罐水平上产厚垣孢子的适用性情况。发酵罐搅拌转速调节为138r/min、溶解氧⒛%~30%,其他发酵参数都与最优发酵条件相同,发酵8天取发酵液测定。

2结果与分析

2.1 BBD试验结果与分析根据表1进行响应面BoxJehnkell D函gn(BBD)四因素三水平的试验设计,得到实验共有⒛组,每组试验结果是3个平行样品的平均值,试验设计及厚垣孢子产量如表2所示:表2结果表明:不同因素组合发酵厚垣孢子产量差异很大,范围在3,臼×107~9”×107'~/nll。组合的最高产量是最低产量的两倍,因此各发酵因素的优化能显著提高厚垣孢子产量。进一步采用“对表2实验数据方差分析(表3),采用Manual模式进行多项式回归,并建立回归方程。利用肛检验确定此模型及各参数的显著性。由表3可知,该模型P<0.O001,失拟项0.6072不显著,说明此模型建立能够涵盖所有实验数据,而由实验误差导致的不能拟合情况可以忽略;各因素的显著性分析可知,大豆饼粉-玉米粉用量(P<00001)、甘油添加量(P=0。∞79)对厚垣孢子产量影响显著,初始pH值(P=0,1095)、装液量(P=03331)影响不显著。两两因素交互项:大豆饼粉-玉米粉用量和甘油添加量(P=0.0033)、大豆饼粉-玉米粉用量和装液量((0.0001)、装液量和pH值(P=0,0014)的交互作用对厚垣孢子的发酵产量影响显著。式中y为厚垣孢子产量,回归方程相关系数r(a内)为0.9948(r)0⒛),表明该方程与实验真实值拟合度高,进一步说明模型构建能够充分优化出棘孢木霉勿sⅩ∞O3发酵产厚垣孢子的工艺条件。

2.2三维响应曲面图和二维等高线分析根据回归方程绘制三维响应面图和二维等高线图,根据图1~图3分析两两因素交互作用对棘孢木霉ZJSⅩ5003菌株产厚垣孢子的影响,由响应面最高点可知,因素所选浓度范围内存在厚垣孢子最大值,同时这个最高点也是等高线最小椭圆的中心点。等高线的形状可反映出交互效应的强弱,椭圆形表示两因素交互作用显著。由图1可知,当甘油添加量固定某个浓度时,大豆饼粉-玉米粉在⒛~33.乃g/L范围内时,厚垣孢子产量随着其浓度增加而增加;大豆饼粉-玉米粉在33.犭~∞g/L范围内时,厚垣孢子产量随着其浓度的增加而减少;说明:最佳的厚垣孢子产量出现在大豆饼粉-玉米粉在33,药g/L附近,而相对应的甘油浓度在。两因素椭圆形等高线图表明:相比大豆饼粉-玉米粉不同浓度变化,甘油浓度的变化对厚垣孢子产量影响更为显著。由图2可知,大豆饼粉-玉米粉浓度和装液量存在交互影响,大豆饼粉-玉米粉浓度在范围内变化时,装液量对厚垣孢子产量的影响更为显著,当装液量固定,大豆饼粉-玉米粉用量分别厚垣孢子产量基本相同;说明:与营养成分相比,发酵条件的变化会对厚垣孢子产量产生更大的影响。图3所示,装液量和pH值对厚垣孢子交互影响,由其等高线的椭圆形性质可知,装液量和pH值的交互作用显著,从椭圆的延伸方向可知pH值对厚垣孢子产量的影响更为显著。

2.3参数优化及验证根据上述构建的回归方程模型,进行计算求解,获得模型参数的最佳优化值,即最佳工艺参数:大豆饼粉-玉米粉用量33。乃g/L、甘油添加量886ml/L、装液量∞,35ml/5OOml、初始pH值3.%,此时预测的厚垣孢子产量为9.56×107个/ml。采用得到的最佳发酵条件进行验证试验,3次平行试验得到实际平均厚垣孢子产量为9.泓×107'~/ml,实际产量达到理论预测值的叨.臼%,十分接近预测值,证明该模型较好地预测了实际发酵情况。进一步采用10L发酵罐进行适用性验证,厚垣孢子产量达到1乃×10:个/lall,比摇瓶发酵的产量高,推测是发酵罐的通气、溶氧等条件比三角瓶更为优越,同时证明本试验结果对实际应用有指导意义。图4显示发酵液中的厚垣孢子在显微镜⒛0、10OO倍下的观察图片,左边是⒛0倍下的观察图片,可以看出厚垣孢子产量很大,且基本没产生分生孢子,说明发酵液中厚垣孢子的密度和纯度都很好;右边是10OO倍下的观察图片,可以较为清晰地看到厚垣孢子的壁很厚,且内含饱满,说明产生的厚垣孢子抗性和活性都本文首次利用响应面法优化了棘孢木霉ZJSX50∞生防菌株高产厚垣孢子的发酵条件,根据试验数据及分析得出:4因素对厚垣孢子产量的影响从大到小依次为:大豆饼粉-玉米粉用量、甘油添加量、初始pH值、装液量,其中大豆饼粉-玉米粉用量和甘油添加量对厚垣孢子产量影响显著;两两交互项:大豆饼粉-玉米粉用量和甘油添加量、大豆饼粉-玉米粉用量和装液量、装液量和pH值的交互作用对厚垣孢子的发酵产量有显著影卩向;绘制了上述交互作用影响显著的两两因素间二维等高线图和三维响应曲面图;通过构建多项式回归方程,寻优得到最佳发酵条件为:大豆饼粉-玉米粉用量33g/L、甘油添加量886m1/L、装液量∞,35nal/5OOml、初始pH值3笳;此日寸预测的厚垣孢子产量为9,56×107/ml。在此最佳条件下,实际测得厚垣孢子产量为9.×107个/ml,达到理论预测值的叨.OT%,且比优化前提高。进一步将优化好的发酵工艺在发酵罐上进行适用性验证,其产量高于摇瓶试验结果,达到1,9~b^×10:个/ml,证明本试验结果具有实际应用参考价值,为该菌株规模化生产厚垣孢子提供初步发酵参数。本试验中所用的发酵培养基配制简单,仅需大豆饼粉、玉米粉和甘油三种原料,且主要原料大豆饼粉为工业上大豆榨油后的剩余物,价格低廉,比庄敬华等[20]研究结果中适宜产厚垣孢子的PD、理查德培养液、玉米粉-酵母膏培养液,邹勇等[⒛]和李锋等[22]研究得到的最佳产厚垣孢子培养基——燕麦粉培养液,潘玮[23]采用的由无机碳氮源组成的培养基,还有秦芸等:24J研究得到的适宜产厚垣孢子的最佳培养基——Gorodkowa都更适于在生产上应用。本研究的最佳初始pH值为3,这与顾金刚等[25J研究的长柄木霉ACC∞0150与哈茨木霉ACC∞O371最佳初始pH分别为5、6相比稍低,但与庄敬华等[20]和潘玮:23]研究所得结论相符,即在适于木霉生长范围内,低pH易于厚垣孢子的产生。

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