溶瘤腺病毒靶向癌症治疗的临床研究进展

肿瘤是严重威胁人类健康的疾病,目前,临床治疗的主要手段包括手术切除、放化疗等,但这些治疗方法会给人体正常细胞带来严重的损伤。因此,开发一种安全、有效的方法进行肿瘤治疗逐渐成为人们所关注的问题。而早在上世纪∞年代科学界曾有人提出病毒治疗肿瘤的设想,即利用各种病毒的细胞毒性杀死肿瘤细胞。1956年美国国立癌症研究所(NCI)采用不同血清型的野生型病毒治疗子宫颈癌,半数病人呈现肿瘤抑制且没有毒性[19]。于是,人们便发现了更多病毒具有天然的溶瘤特性。随着对腺病毒分子结构、功能以及感染机制的进一步深人了解,2001年,刘新垣院士提出的癌症靶向-病毒治疗策略成为了最有前景和最活跃的领域之一,即通过基因工程手段将腺病毒改造成具有肿瘤靶向性的溶瘤腺病毒。目前已广泛地用于临床试验研究

1溶瘤腺病毒的种类

溶瘤腺病毒可以选择性地在肿瘤细胞中进行感染和复制,最终裂解肿瘤细胞并释放,以感染更多的肿瘤细胞而不伤及其他正常细胞、组织,是一种具有抗肿瘤药物的靶向性载体作用的病毒。目前,有关溶瘤腺病毒的具体构建方法每个实验都有自己的特点,没有统一的方法可循[3]。而基于AdEasy系统的构建方法是目前比较常见的。其主要过程:(1)构建新质粒,利用AdEaw系统中的骨架质粒和穿梭质粒在大肠杆菌细胞BJ5183重组后,共转染HE093细胞形成溶瘤腺病毒载体;(2)体外研究病毒的复制和杀伤效应;(3)建立动物模型,体内研究病毒的抗肿瘤效应。随着生物技术的快速发展,目前推出的溶瘤腺病毒种类主要有3类。

(1)第一类溶瘤腺病毒,是去除了腺病毒E1B 55kDa基因。该类溶瘤腺病毒主要包括ONYⅩ⒑15和H101两种,然而通过此方法构建的腺病毒具有一定局限性,主要在于这种腺病毒只针对Ⅱ3缺陷型肿瘤细胞,而在人类癌症中,p-s3大约有50%会突变。其次,删除了E1B55kDa基因,会使得腺病毒的增殖变慢,从而减弱了抗肿瘤效能。

(2)第二类溶瘤腺病毒,是为限制病毒在特异的肿瘤细胞或组织内复制,利用肿瘤特异性启动子如肿瘤特异性抗原、端粒酶和生存素启动子等重组到溶瘤病毒基因组中[4],并控制病毒复制所必需的基因,进而控制病毒的复制。肿瘤特异性启动子是驱动肿瘤细胞中特异蛋白表达的启动子。如hu等[5]构建了2个重组腺病毒Ad·AFP·D55-II24和Ad·AFP·TRAIL,去除了EIβ55kDa基因后,用肝癌特异性α-Fetoprot0n(AFP)启动子控制E⒒的表达,在2个重组腺病毒上分别加载抑癌基因IL-24和TRAIL,研究发现其能够诱导癌症细胞的凋亡,显著抑制Huh刁移植瘤的生长。但是,使用该方法的主要局限是,它们不是在所有肿瘤类型中都有活性,即使在同一种肿瘤中,也不可能所有的细胞都表达一种特异性肿瘤标志物。

(3)第三类溶瘤腺病毒,是在第二类腺病毒的基础上,对腺病毒衣壳蛋白进行改造修饰,改变了病毒亲嗜性,从而特异性靶向肿瘤细胞。Ranki等[6]则在此基础上构建了一种新型的依赖p16通道的溶瘤腺病毒Adb pK7姓24,它在纤毛蛋白C端多聚赖氨酸的存在下,其亲和力趋向乙酰肝素蛋白聚糖(HsPG).

以上三类腺病毒显示了良好的应用前景,然而,不同的病毒有着复杂的生物学特性,而目前人类完全熟悉的病毒资源仍旧比较匮乏。尤其大多临床前实验资料均是来自免疫缺陷动物体内人肿瘤移植模型,与人在体内环境、组织细胞的生物学特性等方面都存在很大差异。

2溶瘤腺病毒的癌症靶向策略

溶瘤腺病毒肿瘤靶向治疗除要保证溶瘤腺病毒能在肿瘤内复制的特异性和选择性外,还必须具有靶向性,而腺病毒本身是缺乏肿瘤靶向性的。理想地说,用于肿瘤治疗的溶瘤腺病毒应该既安全又有效,并可靶向特定细胞或组织[9]。近年来,围绕腺病毒改造成溶瘤腺病毒后如何增强其肿瘤靶向性等开展了大量的基础研究。下面就近年来有关溶瘤腺病毒发展的不同癌症靶向策略作一简要总结。

2.1转录靶向策略

转录靶向策略是指溶瘤腺病毒进入肿瘤细胞后,受各种转录元件的复杂调控将目的基囚定位于靶位点进行条件性或选择性表达的目的。基于上述一类和二类溶瘤腺病毒的构建方法均能实现转录靶向。通常情况下,基因表达框主要由3个部分组成:增强子-启动子,基因编码系列和poly(A)尾。并且,很多文献已经报道了利用启动子[10]等进一步增强转录靶向性的策略。研究发现,不同启动子对肿瘤细胞和对病毒基因的调控能力是不同的。如hTERT(人类端粒酶逆转录酶)在超过85%的肿瘤细胞中活性都很高,而在正常细胞中不表达或没有活性。因此,利用hTERT启动子来控制ElA基因可使其只在肿瘤细胞内特异性表达并发生溶瘤作用,而不影响正常细胞。另外,利用存活蛋白基因启动子可实现杀伤肿瘤的靶向性[11]。如Kamizono等构建了由存活蛋白基因启动子控制Rb结合位点突变的ElA基因的重组腺病毒乩w CRAmt,发现了该重组病毒具有广谱的杀伤肿瘤作用。除此以外,相同肿瘤细胞内,不同启动子的调控能力也是不同的。如MUC1基因启动子调控前凋亡基因(B抠),在卵巢癌细胞系及卵巢癌小鼠模型中表现出特异性肿瘤细胞杀伤性作用.

2.2受体(转导)靶向策略受体靶向是指溶瘤腺病毒感染并进人肿瘤细胞的效率c腺病毒进入宿主细胞是一种受体依赖的主动过程。溶瘤腺病毒的转导效率与其感染宿主细胞的过程紧密相关,而该过程受其蛋白衣壳结构影响。研究表明[叫,腺病毒进人细胞需要两种不同类型的细胞受体,一种与病毒附着而另一种介导病毒的内化。以5型腺病毒为例,病毒首先通过衣壳纤维的顶球区域的羧基末端与细胞受体柯萨奇病毒/腺病毒受体(CAR)高亲和力地结合,紧接着五邻体基底上的RGD多肽序列与宿主细胞的第二种受体,整合素αⅤβ3和αvβ5相互作用,通过受体介导的胞吞作用使得病毒颗粒内化。但也有许多研究表明,CAR在很多肿瘤细胞中表达水平较低或缺失,严重阻碍了其感染效率。因而,为克服这方面的困难,利用第三类腺病毒的构建原理,可以有效提高其转导靶向性。

2.3组织或器官靶向策略

虽然通过转录和转导靶向有助于提高溶瘤腺病毒的肿瘤靶向性,但是这两种策略因其给药途径从而使腺病毒的靶向应用受到限制。一般来说,静脉注射可使腺病毒通过血液循环迅速分散到全身各部位,但是,静脉注射腺病毒会很快被自然存在的腺病毒中和抗体[阝]或后天产生的抗体清除。因此,如何既能利用静脉给药这种最为便利的给药途径,又要避免静脉给药的种种不利因素既是难点又是研究的热点。目前研究如图1所示,目前,利用病毒作为癌症基因治疗载体主要包括腺病毒及腺相关病毒、单纯疱疹病毒、牛痘病毒、逆转录病毒等。其中,腺病毒及其腺相关病毒的临床试验总数所占比例明显高于其他病毒载体的临床试验数目。数据表明目前全世界正在转向腺病毒癌症基因治疗研究中。而由腺病毒经过基因改造的溶瘤腺病毒则成为当前最热门的癌症治疗研究之一。其相较于其他溶瘤病毒的主要优点在于:(1)腺病毒的基因结构与功能研究得比较清楚;(2)基因组长度为36kb,易于重组,可插人大片段治疗基因包括自杀基因、细胞因子、抑癌基因和抗血管生成基因等:(3)转染范围广且转染率较高,有效提高了其靶向性;(4)腺病毒的DNA进人宿主细胞后,不整合到细胞基因组,无插人突变,安全性较高:(5)腺病毒的治疗浓度较高,可复制出稳定性好、基因转移效率高的病毒,易于纯化及制各。因此,它比起其他抗肿瘤药物,已经体现出了诸多优势,而且在临床上也逐渐得到了实际应用。下面主要介绍以下两种溶瘤腺病毒基因治疗药物:(1)H1019O05年,国家食品药品监督管理局(sFDA)批准了世界上首个溶瘤腺病毒HI01(叉名安柯瑞)用于肿瘤患者的治疗后,极大地推动了国内外溶瘤病毒临床转化应用的研究。其溶瘤机制是利用了第一类溶瘤腺病毒的构建方法。另外,H101联合化疗药物5’-氟二氧嘧啶效果比单用效果好,其Ⅲ期临床研究探讨了123例患者单用和联合化疗药物使用的差异,结果表明前者患者的缓解率为57%,后者为9.6%[33]。此外,胡放等[34]开展了溶瘤腺病毒H101对分别患有鼻咽癌、肺腺癌、左背部骨旁质肉瘤、膀胱癌等五位病例的相关研究实验,发现H101结合局部加热效果均显现出不同程度的远端抗瘤效应,为利用H101更有效地治疗癌症提供了临床研究基础。

(2)ONYX-015大量研究表明,溶瘤腺病毒是个不错的抗肿瘤候选药物之一,但是就目前来看,许多溶瘤腺病毒的相关产品更多的都还处在临床前和临床试验。其中,有关溶瘤腺病毒临床试验最详尽和完整的数据来源于美国Onyx PhamaceuJcals公司研发的oNYⅩCl15(叉称d11520),利用缺失E1B55kDa的A亚乃杂合溶瘤腺病毒0NYⅩ15开展了一系列I/Ⅲ临床试验研究,给予不同癌症患者以不同途径单次或多次给药,进而获得了具有一定价值的临床资料和数据。但是,应用ONYX-015会出现流感样症状,包括发热、寒战、疲劳、倦怠、恶心等不良反应,因此,需要进一另外,目前溶瘤腺病毒用于基因治疗的主要还有Ocap1、Delta-243GD等(表1),如表所示,目前在研究溶瘤腺病毒癌症基因治疗的临床试验中,美国在此领域的科研水平处于世界前列,其多种溶瘤腺病毒产品均已进人临床Ⅱ期。如由Thmoas开展瘤内注射OCaP1研究前列腺癌转移性或局部复发的试验进人I期研究、由RedeH次开展条件复制性腺病毒复发治疗恶性胶质瘤的临床试验进人I期研究等,均显示了溶瘤腺病毒癌症基因治疗的良好的发展前景。除美、英外,亚洲国家韩国也有实验室研究复制性腺病毒介导自杀基因疗法用于癌症基因治疗,且其结合放疗手段治疗中高风险前列腺癌的研究进入Ⅱ期。说明溶瘤腺病毒的癌症基因疗法已经成为世界各国的重点研究方法,它是一项既有挑战性叉极具前景的工程。此外,在国内,有研究者也进行了一定的临床试验。如施静等[35]进行了ΚH901对头颈鳞癌患者的I期临床试验的研究,发现受试者均有不错的症状缓轻效果。除此以外,仍有许多相关研究者正在积极地从事溶瘤病毒癌症基因治疗的研究,如N忆等[36]利用缺失IGF2印迹系统(IGF2LOI wstem)构建的溶瘤腺病毒能在体内外抑制结肠肿瘤的增长。尽管很多还未进人临床试验,但是基础实验室的研究成果证明了基因-病毒疗法的重要价值,溶瘤腺病毒产品将会成为未来极具前景的癌症基因治疗热点药物。

然而,作为溶瘤病毒家族中的一大类,溶瘤腺病毒的研发无论是在实验室还是在临床上均处于本领域的领先地位,是研发品种最多、临床试验研究涉及肿瘤类型最广的溶瘤病毒。而如何使溶瘤腺病毒药物有效地靶向肿瘤部位,这对其给药途径提出了很高的要求。目前,溶瘤腺病毒产品的输送途径主要包括瘤体内注射、腹腔内注射、动脉与静脉内注射等。传统给药途径是瘤内注射,优点是局部药物浓度很高,但其扩散受限,对于较大肿瘤需要进行多部位重复性注射,而大多数肿瘤手术或放化疗后,复发是多中心的,此时,瘤内注射并不适宜。如期望从溶瘤病毒治疗中获得良好的效果,应考虑血管内注射病毒至肿瘤部位。如h等[37]采用介人手段将微导管插入肿瘤供血动脉,将A山腺病毒注射液注入肿瘤,可使药物均匀、高浓度地分布于肿瘤组织从而发挥治疗效果。因此,在临床研究中,腺病毒输送途径是影响癌症靶向治疗效果好坏的重要因素之一。

此外,有人提出利用溶瘤腺病毒联合化疗等手段就可以明显观察到这两种方法的协同抑癌作用。我国溶瘤腺病毒突变体联合标准化疗等手段治疗鼻咽癌已经被逐渐接受,溶瘤腺病毒联合化疗可分为未携带治疗基因的溶瘤腺病毒联合化疗和携带治疗基因的溶瘤腺病毒联合化疗。前者治疗方法的案例中,如ONYⅩ⒑15联合化疗治疗肿瘤中,由Galanis等t4O∶主导的一项使用ONYⅩCl15治疗早期肉瘤的I、Ⅱ期临床试验中,在6例患者中5例可观测到抗肿瘤活性;Yoon等[41]用AD-AE1B19/55联合顺铂对Hep3B人月干癌细胞、A549人肺癌细胞、3A人子宫颈癌细胞进行实验研究时发现,对肿瘤细胞有明显的杀伤作用;利用携带hTRAIL\E1B55kDa蛋白基因缺失的溶瘤腺病毒ZD55llTRAIL联合5FU对SW620人结肠癌细胞进行体外实验发现其对肿瘤细胞产生明显的协同增强杀伤效应。值得一提的是,2007年,Qu△in等[43]构建了特异性靶向黑色素瘤的溶瘤腺病毒AD5/3.2xTyr,并得出其联合替莫唑胺对黑色素瘤细胞株的杀伤作用。而在携带治疗基因的溶瘤腺病毒联合化疗中,显示出了良好的研究成果。此外,本实验室另一课题组郭科妮等[44]构建了携带"LC1基因的双靶向溶瘤腺病毒,联合阿霉素对SMMC-7721肝癌细胞的杀伤作用进行了实验研究,显示了两者的协同抗癌作用。而近年来,国外Kahberova等[45]构建了一种新的溶瘤腺病毒CRAdRGDntI⒓4联合TMZ研究了其在以小鼠为模型的抗神经胶质瘤的效果,结果显示两种手段的结合有效地抑制了肿瘤生长,延长了小鼠的寿命;贝刂通过对病毒外壳修饰的手段,研究了对胰腺癌的抑制效果,显示了一定的疗效。2012年,相继进行了溶瘤腺病毒联合长春新碱(ⅤCR)化疗药物体外研究对成视网膜细胞瘤的抑制效果,显示了其一定的肿瘤杀伤作用,具有一定的治疗前景。腺病毒的研究发展极为迅速,尤其是溶瘤腺病毒,让人看到其在未来临床治疗癌症的应用前景。此前,也有人针对前列腺癌的两个溶瘤腺病毒C89O和A凼￡D/Tep)已经对其进行了三个临床试验。在各自的I期临床测试试验中,局部复发的患者接受了前列腺静脉注射后的病毒初级放疗,肝功能均表现出了一定的抗病毒性,之后"A水平有所降低;另有Ad5CD/TKrep[49]经直肠超声引导注射到16名患者,最终辐射治疗前列腺癌,两天后,再给予5-FC/GC进行治疗,结果%%的患者均有不同程度的病情缓和。以上的三个病毒虽然均已有不错的I期研究成果,同时也分别进人了Ⅱ期的

4结语

肿瘤的生物治疗中,基因治疗是目前一个重要发展方向。而溶瘤腺病毒靶向治疗肿瘤则是肿瘤基因治疗的一个显著策略。由于溶瘤腺病毒具有肿瘤特异性溶解作用,但对正常细胞不产生影响的特点,使之成为热点研究抗肿瘤药物之一。虽然,溶瘤腺病毒的研发无论是在实验室还是在临床上均处于本领域的领先地位,但是以溶瘤腺病毒为基础的病毒治疗要应用于临床还存在许多障碍要克服。如溶瘤腺病毒固有的免疫原性,易引起局部组织炎症反应和机体免疫原性反应。为此,有学者就降低其免疫原性做了相关实验,值得欣慰的是,其结果表明使用抗CM药物和免疫抑制剂如环胞霉素、FK506和环磷酰胺等能抑制中和抗体的产生[51],并降低腺病毒对宿主的免疫反应。此外,溶瘤腺病毒免疫学机制研究中的动物模型问题和分子成像技术、细胞载体的选择和优化以及靶向舯瘤干细胞治疗等也是重点关注的问题。随着生物学技术的不断发展,溶瘤腺病毒在癌症靶向治疗中的安全性、特异性、溶瘤性应该会得到吏好的改善。同时,将会有更多、更好的溶瘤腺病毒药物进人临床试验,进而真正地应用于临床,造福人类。

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