生物质能源发酵中染菌及防控的研究进展

随着经济的不断发展,传统化石能源短缺的问题日益凸显,人们对新能源的关注与日俱增[1]。与此同时,全球气候变化和C02减排压力日益严峻,因此许多国家致力于研究开发可再生的新能源,如太阳能、风能、地热能、海洋能、生物质能和氢能等[2]。其中生物质能源具有清洁、可控、低成本、可持续等优势,在全球能源供应中的份额不断增加。目前,生物质能源已成为世界第四大能源和总量最大的可再生能源,其消耗量仅次于煤炭、石油和天然气[3].生物质的利用方式包括直接燃烧、热化学转化和生物转化技术.直接燃烧是最原始的生物质利用方式;但直接燃烧不仅利用率低,造成严重的资源浪费,而且会污染环境。热化学转化技术主要通过热化学反应的方式将生物质大分子(如木素、纤维素和半纤维素等)分解成较小分子的固态、液态或气态的燃料物质(如固态炭、可燃气、生物油等)。热化学转化技术工艺复杂、成本较高,而且产率往往较低,产物复杂且难以分离[4]。生物转化技术则主要通过发酵方法从生物质中制取液体燃料或气体燃料,其条件温和、环境友好,是目前研究的重点。生物转化技术制取的燃料产品包括生物乙醇、生物丁醇、甲烷、生物柴油等。生物质能源具有巨大发展潜力,除去在农村已得到广泛应用的沼气外,利用酿酒酵母发酵生产燃料乙醇的技术发展迅速,乙醇汽油的应用可有效缓解应用化石能源的压力。此外,利用丙酮丁醇梭菌发酵产丁醇,利用蓝藻生产甲烷等多种新型生物质能源的生产方法,也越来越受到人们的重视。然而,生物能源发酵生产依然面临诸多问题,如非粮原料利用技术不成熟、高渗[9]、高温[⑩]、产物胁迫[1l]以及杂菌污染等。杂菌污染一向都是生物质能源发酵工业中不能彻底解决的问题,染菌可导致产品产量下降,从而直接影响生产效益,降低生物质能源的市场竞争力,因此如何防控生物质能源发酵过程中的杂菌污染是人们研究的重点之一。本文介绍近年来关于生物乙醇及其它生物质能源发酵中杂菌产生的原因、杂菌污染抑制生物质能源发酵机制的研究进展,并对防控杂菌污染的进展进行综述。

1生物乙醇发酵中的杂菌污染及防控

1.1生物乙醇发展现状

在众多可再生能源中,生物乙醇是规模最大的发酵产品,其产量居世界生物技术产品之首[14]。在一些国家和地区,生物乙醇已作为汽油替代品广泛使用。美国是全球最大的生物乙醇生产国,美国联邦政府在2001年提出“生物质能是一种值得探索和推动的替代能源”,2010年10月,美国环境保护署(EPA)宣布同意将汽油中的乙醇含量上限由10%提高至15%,以节约能源、促进低碳经济发展。巴西每年大约生产83亿升乙醇用作汽车燃料。我国也在积极推广乙醇汽油的使用。据国际经济合作发展组织与联合国粮农组织2008年报告,预计到2017年,全世界的乙醇产量将达到1250亿升。

传统的发酵法生产乙醇以玉米、小麦、高粱、薯类、植物纤维、糖蜜、大豆和谷物等为原料,经水解、发酵转化为乙醇。然而,以粮食为原料生产燃料乙醇存在“与人争粮,与人争地”的问题,将影响国家的粮食安全。木质纤维素是地球上最丰富的可再生资源,据估计,木质纤维素原料约占世界生物质总量的50%,因此利用木质纤维素等非粮原料生产燃料乙醇已成为各国研究的重点[16]。里氏木霉(可发酵生产木聚糖酶,将纤维素高效分解为可发酵性糖,为发展基于非粮原料纤维素的乙醇生产奠定了基础[17]。尽管纤维素乙醇发酵依然存在乙酸[⒙]、糠醛、5-羟甲基糠醛[lQ]、芳香类化合物[20]等纤维素降解物胁迫问题,但近年纤维素乙醇研究应用依然获得了极大进展。目前,我国纤维素乙醇的发展也很迅速,国家发改委已核准了广西的木薯燃料乙醇、内蒙的甜高粱燃料乙醇和山东的木糖渣燃料乙醇等非粮试点项目,山东龙力公司已于2012年建成了年产5.15万吨的玉米芯纤维素乙醇项目。

1.2生物乙醇发酵中染菌机制

酿酒酵母是生物乙醇发酵中使用最多的微生物。尽管乙醇发酵长期处于酸性环境,相对来说有利于防止杂菌污染,但在生产过程中,种子染菌、连消系统灭菌不彻底、补料液带菌、补料管渗漏等问题经常发生,从而导致产业规模的酿酒酵母发酵生产乙醇经常受到杂菌污染的影响。各种杂菌的存在会抑制酿酒酵母细胞的生长,造成生物乙醇产量下降,并最终导致巨大的经济损失[25.96]。在这些污染的杂菌中,乳酸菌以其繁殖速率快、具有一定程度的乙醇耐受性和低pH耐受性等特点,成为生物乙醇发酵生产中的主要杂菌。比如smer等[27]的研究表明乳杆菌属是生物乙醇发酵中最主要的污染杂菌,他们沿着燃料乙醇生产线,从一个湿磨机和两个干磨机设备中分离杂菌,其中湿磨机不加抗生素,第一个干磨机只在扩培罐加人抗生素,第二个干磨机在发酵过程中每隔4小时加人抗生素,结果表明在3个不同的设备中,乳杆菌分别占所分离总杂菌的51%、38%和77%。

乳酸菌对酿酒酵母发酵产乙醇的抑制作用主要体现在三个方面。首先,乳酸菌产生乳酸,使发酵体系pH值降低,从而抑制酿酒酵母生物量及乙醇产量。av等的研究结果表明,4%(w/v)的乳酸即可使乙醇产量明显降低。其次,乳酸菌可与酿酒酵母竞争生存环境,从而抑制酿酒酵母的生长繁殖。微生物之间普遍存在生存竞争,它们要为适应环境条件而竞争,乳酸菌与酿酒酵母共处于同一封闭环境,必然会争夺其生存环境。最后,乳酸菌可与酿酒酵母竞争发酵液中的糖及微量营养素等物质。Bayrock等[29]的研究结果表明,在无乳酸菌存在情况下,当乳酸添加量为3解%(ll/v)时,酵母细胞生物量降低程度高于乳酸添加量为5.35%(viT/v)时;此夕卜,加人4.14%的乳酸虽然会使整体发酵体系的乙醇产量由48.7g/L降至145g/L,但是单个酵母活细胞的乙醇产量却提高了大约3.2倍。而乳酸菌的加人则会使酵母生物量和乙醇产量都明显下降。相比于乳酸含量增加导致发酵体系pH值降低而造成的乙醇减产,乳酸菌对于发酵液中糖及微量营养素等物质的竞争对酿酒酵母发酵产乙醇产生的影响更为关键。

1.3生物乙醇发酵中杂菌抑制方法

如何有效地控制杂菌污染,使酿酒酵母生长不受抑制并进而增加乙醇产量,是近年来人们研究的重点之一。研究人员已经尝试了多种方法以达到控制或消除乳杆菌等杂菌污染的目的,比如向生物乙醇发酵体系中添加抗生素[25]、防腐剂[3033]和乳酸盐[Rl]等。然而,抗生素的滥用可导致细菌出现严重的耐药性,使抗生素的作用效率降低[34];同时,耐药性基因会随发酵废渣、废水扩散进入土壤、水体等环境中,造成二次污染,并进而加剧细菌耐药性的扩散,威胁人、畜等的健康安全。Zhtl等[35]的研究表明抗生素的使用可导致环境中耐药性基因的出现和扩散,他们在中国选取了3个使用除万古霉素外主要类型抗生素的大型养猪场,用养猪场粪肥处理土地后分三个阶段分别取样,进行高通量定量PCR检测,在所有样品中发现了149个耐药性基因,这表明抗生素的使用会引起环境中抗生素耐药性基因的出现和传播。至于添加乳酸盐,虽然外源乳酸盐可有效抑制乳杆菌的生长,但是必须筛选耐乳酸的酿酒酵母菌株用于生产生物乙醇,而目前对于酿酒酵母乳酸耐受机制了解尚浅,耐乳酸酿酒酵母菌株是否适合应用于工业生产仍需进一步研究,而且外加乳酸将会极大降低酿酒酵母的发酵能力。在高温下使用耐热酿酒酵母菌株发酵也可降低杂菌污染的风险。然而,大部分用于工业规模的酿酒酵母菌株的发酵温度只可高至35℃,而且高温会增加生产成本,降低生物乙醇的市场竞争力。此外,在固态乙醇发酵混合物中加人浓度为~sOg/Kg的外源乙醇也可防止杂菌污染。添加外源性乙醇后,乙醇收率达到0.5g/g,比未添加时的0.39g/g,收率提高28%。采用外源乙醇控制杂菌污染简单易行,环境友善,而且乙醇本身作为产物可以循环利用,不会增加生产成本,是工业生产中切实有效的方法[30]。近年来有人提出在乙醇发酵中利用噬菌体进行染菌防控。研究表明,在发酵系统中加人适量噬菌体混合液,最终获得的酸浓度实现乙酸不大于030%(重量/体积)和乳酸不大于0,80%(重量/体积)[39]。其他可能控制杂菌污染的方法,还包括使用亚硫酸盐、过氧化氢:34]、壳聚糖[+l]、来源于牛乳铁蛋白的肽[42]、硫酸[43铆]以及药用植物提取物等。与抗生素和防腐剂的环境威胁相比,使用亚硫酸盐、过氧化氢、乳酸盐、壳聚糖、来源于牛乳铁蛋白的肽、硫酸以及药用植物提取物等物质抑制杂菌污染较为安全,然而应用成本较高。

2其他生物质能源发酵染菌及防控

2.1生物丁醇

生物丁醇是一种极具潜力的新型生物燃料,其热值和汽油相当,将其作为替代燃料能大大减少温室气体的排放,具有显著的环境效益。与乙醇相比,丁醇热值更高,与汽油的配伍性更好,能够与汽油达到更高的混合比[45];此夕卜,丁醇还具有蒸汽压力低、腐蚀性小、便于管道输送等优势[46]。生物丁醇一般由丙酮丁醇梭菌在严格厌氧条件下发酵产生,其发酵可分为产酸阶段和产溶剂阶段,主要发酵产物是丁醇、丙酮和乙醇,其产物比例是⒍⒊1,也称为ABE发酵或AB发酵[47]。A:E发酵是最古老的发酵工业之一,曾经在生产规模上仅次于乙醇发酵。但从20世纪60年代以后,由于化学法合成丁醇工艺的日渐成熟,ABE发酵工业逐渐萎缩。近年来,由于人们对生物丁醇作为可再生能源的期望,ABE发酵再次受到重视。在生物丁醇发酵过程中同样面临杂菌污染的问题,其中危害最严重的也是乳杆菌,这主要是由于丙酮丁醇梭菌的发酵环境同样也适合乳杆菌的生长。工业生产中一旦发生大面积乳杆菌污染,且无法得到及时有效的处理,将给生物丁醇发酵带来严重损失。由于丙酮丁醇梭菌可产生耐高温的芽孢,因此可采用热处理法抑制杂菌污染,在发酵前通过加热富集芽孢、杀死污染杂菌。发酵过程中的厌氧生产环境可以淘汰好氧菌,同样可起到去除杂菌的作用。这些处理方法的应用可极大降低生物丁醇发酵染菌几率,因而关于生物丁醇发酵的研究较少涉及杂菌污染问题,而更多关注产物耐受性强的工程菌构造及丁醇产率等问题。

2.2基于藻类发酵生产的生物燃料

近年来,人们对利用藻类生产生物燃料的兴趣越来越大,这是因为许多藻类菌株可以产生大量的储存脂肪,进而转换为生物燃料。由于藻类的生长不占用土地和淡水这两大资源,因而利用藻类生产生物燃料不存在与粮食作物竞争土地的问题;并且在生产的同时,藻类可通过光合作用以及吸收氮、磷等元素,在一定程度上防止气候变暖和修复富营养化海域,从而达到改善环境、保护生态平衡的目的。与其他能源作物相比,藻类的生长速度很快,通常从生长到产油只需要两周左右。它的产油量也非常可观,一亩大豆一年约产油300公斤,而一亩海藻一年至少能产油2~3吨。基于藻类产油特性而进行的后续生物燃料生产包括两种方式。第一,海藻的油脂提取物可通过精炼等值转换为生物柴油、喷气燃料和汽油等液体燃料[49]。精炼剩余的藻渣可分离出淀粉,进而通过添加不同的生产菌株进行发酵生产乙醇、甲醇等不同的生物燃料。此过程可利用现有的炼油设各,且使用藻类燃料无需改变目前市场上汽车发动机基础结构,因而实用性强,潜力巨大。第二,多数藻类植物能制造出大量的碳水化合物等中间产品,这些产品经过发酵处理可转化为生物燃料,对于解决能源危机也具有重要意义。例如,巨藻作为“能源新秀”逐渐被人们所重视。研究发现,将微生物加人粉碎后的巨藻进行发酵,每1000吨巨藻粉可产生4O00m3以甲烷为主的可燃性气体,转化率可达20%以上[2]。利用藻类生产生物燃料要考虑诸多问题,比如,在藻类培养阶段,细菌污染、藻类天敌等因素均可影响藻类生长;在后续的转化阶段,精炼过程生产工艺费用较高,生产技术还不成熟。此外,利用藻类发酵生产生物燃料过程中的菌群关系尚不明确,细菌对此过程的影响作用不容忽视。

2.2.1藻类培养阶段的细菌污染细菌污染是藻类培养中尤为严重的问题。通常情况下,藻类的养殖都是处于开放的环境中,微生物与藻类会处于一种微妙的平衡:适量的微生物会消耗一部分营养物质,同时提供另一些有益于藻类生长的物质。而在实验室中,藻类培养阶段应尽量维持无菌纯培养,以使藻类细胞获得迅速增殖,达到产油所需生物量。灭菌不彻底等原因会造成大范围细菌污染。由于异养细菌可与藻类直接竞争生长资源;而且细菌比藻类有更快的生长速率,即使极小的初始染菌量也会导致细菌生物量激增,进而导致藻类生物量大幅降低[s1],从而造成巨大的经济损失。

2.2.2甲烷发酵过程中的菌群关系以藻类细胞作为底物,多种微生物可利用联合厌氧消化作用进行发酵产生甲烷,其过程与沼气发酵基本一致,因而此过程中所涉及微生物可基于沼气发酵中的微生物经过筛选而获得。这些微生物从整体上可划分为产甲烷菌群和不产甲烷菌群,产甲烷菌利用不产甲烷菌的代谢产物H2、C02等最终合成甲烷[2]。对于产甲烷菌群和不产甲烷菌群各自包含哪些细菌,这些不同的细菌如何具体作用,如何相互依赖又相互制约尚不明确。在利用藻类进行生物燃料的发酵过程中,是否存在杂菌污染以及杂菌污染对发酵影响的程度等问题仍有待于进一步研究。

2.2.3藻类发酵生产生物燃料过程中的杂菌防治在实验室中,藻类培养阶段一般需要无菌纯培养,对相关仪器设各严格灭菌可以减少杂菌污染。另外,一些藻类在高盐、高碱等特殊生长环境可以淘汰部分细菌,也可起到去除杂菌的作用。但其成本较高,而生物燃料收益较低,因而此方法难以用于商业化生产[52]。在工业化生产中,藻类的养殖所处的开放环境(池塘、湖泊、近海等)决定了其无法实现无菌纯培养;且如前所述,适量的微生物存在会促进藻类生长。所以,藻类发酵生产生物燃料过程中杂菌防治的重点在于维持微生物种群和藻类的平衡。目前,利用藻类进行生物燃料发酵过程中菌群相互作用的机制仍不明确,尚无有效的杂菌防治方法的相关文献报道。

3结语和展望

生物质能源的利用有利于环境保护和人类健康,对于减缓全球性气候变暖更彰显其突出作用。对生物质能源的利用方式正由传统的直接燃烧方式迅速向现代化生产方式转换,利用发酵法从生物质中制取生物乙醇、生物丁醇、甲烷、生物柴油等燃料,条件温和、环境友好,是当前生物质能源生产的主要方式。但是,生物质能源发酵中的杂菌污染可直接导致生物燃料产量下降,从而带来巨大的经济损失,是工业生产中不容忽视的主要问题之一。随着人对生物乙醇及其它生物质能源发酵中杂菌种类及其污染机制的不断了解,壳聚糖、来源于牛乳铁蛋白的肽、药用植物提取物等新型杂菌抑制物以及添加外源性乙醇、噬菌体等新方法的应用,将有助于控制生物燃料工业生产中的杂菌污染。在此过程中,仍有一些问题需要人们进一步阐释及解决,比如,这些抑制杂菌污染的物质或方法本身对生物燃料发酵主菌株及产品终产量有无副作用?这些抑制杂菌污染的物质会不会随着发酵废渣、废水进人环境土壤或水体,造成环境污染?人们是否能寻找到更安全有效的杂菌抑制物?这些问题将会是今后的重点研究方向,需要相应科研工作者的继续努力。随着科技进步,一些新技术、新手段逐渐应用于生物质能源发酵相关问题的研究,这将极大促进人们对生物质能源发酵中染菌、高渗、高温、产物胁迫等问题机制的理解。本课题组前期利用基于气相色谱质谱联用的代谢组学技术,研究了酿酒酵母细胞对乙醇胁迫的耐受性机制[53]。对酿酒酵母耐受乙醇机制的深刻理解,将协助人们有目的地改造酿酒酵母,为构建更高产的乙醇发酵酿酒酵母菌株提供理论指导,进而有助于提高乙醇发酵转化率及产量。获得对乙醇胁迫耐受性强的酿酒酵母,将有利于一些染菌防控方法的实施,例如通过添加外源乙醇进行染菌防控等[3O]。此外,此技术也为研究生物质能源发酵中杂菌抑制的机制提供了新的平台,使得人们能够更深人理解各种抑菌物质的抑菌机制,进而更有针对性地提高抑菌效果。总之,随着对生物质能源发酵研究的日益深入,人们对其面临的诸如发酵中染菌、高渗、高温、产物胁迫等问题的处理方法将会不断改进,这些方法在工业生产中的应用必将促进生物质能源产业的发展,丰富和巩固能源系统,进而为社会发展、环境保护做出巨大贡献。

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