乳酸克鲁维酵母的发酵优势及在食品酶制剂领域中的应用

自20世纪20年代初成功实现基因重组、导入异源细菌内表达出外源目的蛋白后,基因工程技术如火山爆发般显示出巨大威力。这项技术使原来在人、动物、植物及微生物等生命体中含量极微的蛋白质能够在细菌及其后的其它系统中得以高效表达且易于获得高纯度的物质。在食品工业中,乳制品、食用腐乳和啤酒等的生产中都涉及工程菌。在今天的生物技术领域,利用基因工程技术构建的工程菌在工业生产中也发挥着重要作用。乳酸克鲁维酵母是一种能够以乳酸作为其唯一的碳源和能源的酵母,具有营养要求极其简单、生长旺盛、生物量大、生长温度适应范围广(2546℃)、分泌蛋白能力强,不产生内毒素和对人类安全等优点[I]。所以,在食品酶制剂领域中,乳酸克鲁维酵母得到了广泛的应用,有越来越多的研究者基于乳酸克鲁维酵母以上优良特性并利用其遗传背景清楚的表达系统表达外源蛋白,其中就包括食品工业用酶。

乳酸克鲁维酵母在利用廉价的底物发酵时具有高的菌体密度和蛋白分泌量,适合用来生产低值异源蛋白质[2]。通过查阅近些年相关文献并结合自身实践以发酵生产的角度从生物学特性、菌种选择、发酵工艺优化、表达效果分析、外源蛋白修饰加工诸多方面阐述了乳酸克鲁维酵母发酵特点,并指出其具有独特的发酵优势。与此同时,简要综述了乳酸克鲁维酵母在食品酶制剂领域中的应用。

1乳酸克鲁维酵母的发酵优势

1.1乳酸克鲁维酵母的生物学特性酵母菌是真核生物中很大的一个类群,包括至少10个属,200个种,10000个独立菌株。酵母是单细胞低等真核生物,因而其表达系统兼有原核和真核两种表达系统的优势:既便于培养,基因操作容易,细胞繁殖快,生产成本低,又可对真核基因产物进行翻译后加工,得到正确折叠的、有活性的蛋白。克鲁维酵母因其良好底物利用特性和分泌能力,愈来愈成为近年来日益受到研究重视的酵母属。其中在分子生物学和生理学方面研究相对较深人的是乳酸克鲁维酵母[3],至今已经建立了较为完善的载体-宿主系统。乳酸克鲁维酵母为革兰氏阳性菌,菌体体积大,呈球形,多边芽殖,不产生假菌丝,不产生子囊孢子,无掷孢子。菌落呈乳白色,表面光滑、隆起,边缘整齐,无褶皱,略有光泽,生长在培养基表面,质地细腻有粘性[4]。可从专业网站如CBS(邯唧.cbs.knaw,d)和ATCC上获得有关乳酸克鲁维酵母的具体信息[5]。

1.2乳酸克鲁维酵母菌菌株目前所熟知的商业化菌株GG999是乳酸克鲁维酵母野生单倍型菌株,已应用于食品工业之中,具有良好的蛋白合成与分泌能力[5]。此外,乳酸克鲁维酵母NRRL-Y1140[6刊、RuL1888、ⅤAK367等菌株灌芷庐±酶方面也都具有良好的效果,一般作为工程菌改良的原始菌株。目前,获得工业菌株的途径有多种,如从天然源分离,检索商业化菌株库等。在工业生产中,为了提高菌株的特定蛋白分泌能力,常利用各种突变技术,或者增加其表达框的拷贝数。已证实各种突变能够诱发细胞产生“超分泌”表型,这些菌株也已被开发用来分泌外源蛋白。张萃荟等[9]通过诱变成功筛选出一株适合乳果糖生产的β-半乳糖苷酶高产菌株。Kojger等将外源基因sc〃昆43引人到菌株ⅤAK3臼中,成功得到了改良型菌株ⅤAK367-D4。

1.3发酵工艺菌体处于最适的培养条件下,生长代谢旺盛,产物积累增多,使该菌具有生长速度快、周期短、成分低的特点,便于规模化生产。国内研究者对乳酸克鲁维酵母产乳糖酶发酵工艺进行优化(表1),获得了很好的效果。与酿酒酵母相比,乳酸克鲁维酵母能够适应更广泛的碳源,如葡萄糖、半乳糖、乳糖或淀粉等,这为发酵工艺的优化提供了更便利的条件。所以,研究人员会有更多的机会尝试选择来源广泛、价格便宜的碳源作为发酵原料,降低生产成本。其中,在乳酸克鲁维酵母产乳糖酶过程中,乳糖水平是影响产酶量的重要因素。

发酵培养基中常用的氮源一般为蛋白胨。但是,由于蛋白胨价格较贵,不适于工业化大规模生产,在发酵过程中,可尝试以尿素代替蛋白胨。实验证明,尿素代替蛋白胨进行发酵在一定程度上会使产酶量降低,但考虑成本因素,此方法还是可行的。在金属离子对发酵产酶的影响上,由于Ca2+在培养基中易形成沉淀,影响细胞的收集和酶活的测定,故在优化发酵培养基中尽量不考虑加人C驴+。用于乳酸克鲁维酵母的发酵培养基起始pH值接近自然pH,一般为6,6~6.8之间。实验显示,保持pH在自然水平,有利于酵母大量消耗碳源,延长生产时间,且能够使产物酶的活性形式稳定存在[10]。在菌种种龄的选择上,采用对数生长期的种子进行发酵,得到的酶活偏低;而用稳定期的种子进行发酵,酶活较高。故发酵时宜采用稳定期的种子进行接种。接种量对发酵产酶的影响不大,一般采用2%~5%的接种量。装液量显著影响发酵产酶量的高低,故在发酵过程中选择合适的装液量,尽可能提高溶氧量将有助于提高酶产量。

发酵时间根据不同发酵环境、不同产酶种类而具体设定,一般取菌体浓度和产酶量都达到最大的时间作为发酵时间。在发酵工艺的诸多因素中,温度对于酵母的高密度培养是比较重要的,特别是在利用酵母基因工程菌株生产外源蛋白的过程中,有时较高的温度有利于酵母细胞的高密度发酵,低温培养则有利于提高重组产物的表达量,所以可以在不同培养阶段采用不同的培养温度,这样既有利于提高细胞的生物量叉可以增加重组产物的表达量,并缩短发酵周期[⒖]。研究在乳酸克鲁维酵母G凹99发酵产重组皱胃酶的过程中采用了两阶段的温度控制方式,结果乳酸克鲁维酵母G凹”的生物量和产酶量在变温培养的模式下与单一温度发酵培养相比,细胞的生长周期明显缩短了,与鸩℃或32℃相比重组皱胃酶的产酶量提高了。

1.4表达效果乳酸克鲁维酵母产物表达方式分为细胞内和细胞外两种形式。提取细胞内蛋白常用方法一般有溶剂提取法、机械破碎法、酶法等。不过溶剂提取法和机械破碎法提取效率不高,酶法比较昂贵,声裂提取法成为提取细胞内蛋白的有效形式。声裂提取法是指在提取过程中,辅以微波或超声波提取,借助声波的能量使细胞壁破碎,产物得到有效萃取。为保证产物产量,细胞的生理状态和生长环境是在提取过程中必须考虑的重要参数。MallLlel等[6]的实验证明,声裂提取法具有简单、快速、普遍适用的特点。当然,从上游入手,构建容易释放胞内蛋白的菌株也能解决提取细胞内蛋白的问题。BeceⅡa等成功构建出工程自溶性乳酸克鲁维酵母菌株LHDP1,其表达的β-半乳糖苷酶可以在胞体受到渗透压冲击后有效释放到细胞外。但由于细胞内表达会影响产物产量且在后续分离中涉及到细胞壁破碎等一系列问题,提高了生产成本,故在实践研究中,研究者一般更倾向于采用细胞外表达的形式生产蛋白酶类。董艺凝等[⒙]对嗜热脂肪芽孢杆菌来源的耐热β-半乳糖苷酶吒aB进行乳酸克鲁维酵母真核表达研究,结果表明活性和热稳定性均保持良好,但不能被酵母表达系统有效地分泌到胞外。其原因可能与bgaB的结构有关。该酶为EC32.1。20,按氨基酸序列相似性可归类为糖苷水解酶矽家族(GH砰2),其N端具有典型的TIM结构域,含有的疏水性片段可能不利于酶的有效分泌。朱敬华等成功地将中的亚油酸异构酶基因克隆到pKLAC1质粒上的KJ@c莎泌α结合因子的下游,形成与α-MF融合的蛋白质,并成功地实现了在乳酸克鲁维酵母中的分泌表达,既避免了表达产物被细胞内蛋白酶降解,又大大简化了产物的分离纯化过程。袁伟等[20]以非营养缺陷型乳酸克鲁维酵母G臼”为宿主,以携带有真菌乙酰胺酶基因的乳酸克鲁维酵母表达载体pKLAC1为载体来富集含有多个拷贝表达框的转化子,获得了能高效分泌表达牛凝乳酶原的乳酸克鲁维酵母重组菌株。工程菌分泌蛋白的能力还和培养条件有关,Bece乩等[7]研究表明将乳酸克鲁维酵母分别置于合成培养基和乳清蛋白培养基中培养,其相关基因表达产物的糖基化程度和分泌方式均会有所不同。1.5外源蛋白的修饰加工酵母可以对在其中表达的外源蛋白进行翻译后修饰,如糖基化修饰,使得酵母成为一种潜在的可用来生产需要修饰加工的外源蛋白的表达系统。杨晓鹏等[20]利用乳酸克鲁维酵母Δun3表达出发生了糖基化修饰的sTNFR-IgGFc融合蛋白。乳酸克鲁维酵母同其它酵母一样,当它作为糖蛋白(glycorodn)生产的宿主时,分泌表达的糖蛋白会发生糖基化修饰[22]。酵母和哺乳动物细胞类似,都能进行糖蛋白N-糖基化翻译后的修饰过程,但是最终的N-糖型结构两者却有很大的区别。虽然酵母合成糖基的核心结构与哺乳动物细胞相同,但其糖基外链主要由甘露糖(Mal.no⒃,Man)组成,为高甘露糖型糖基,而不是哺乳动物细胞合成的复杂型糖基。

2乳酸克鲁维酵母在食品酶制剂领域中的应用

2.1利用乳酸克鲁维酵母生产凝乳酶凝乳酶是乳酪生产中的关键酶,能使乳中蛋白质凝聚[23],在乳酪生产过程中用于凝结牛乳、改善风味。传统上利用牛犊皱胃提取制作,随着乳酪产业不断扩大,单纯靠宰杀幼畜的方法来生产凝乳酶已经不能满足现代工业对凝乳酶的需求。由于微生物生长周期短,产量大,不受气候与时间的限制,以微生物为宿主利用基因工程技术生产重组小牛皱胃酶成为解决凝乳酶需求量增加与来源受限的有效途径。乳酸克鲁维酵母具有FDA认证的GRAs地位,允许在多种食品和饲料中应用[20].利用乳酸克鲁维酵母生产的凝乳酶,不仅蛋白质性质稳定、酶活较高,而且表达蛋白能够成功分泌到细胞外,不产生包涵体。利用乳酸克鲁维酵母可调控的LA“启动子,19⒇年实现了凝乳酶基因在其调控下的高表达。K岣ger等构建的重组菌株使用酵母染色体LAC4启动子,使外源蛋白顺利表达,并且即使外源蛋白具有蛋白毒性,菌株也能保持生理稳定。冯镇等[25]成功构建出酵母表达载体pKLAC1巾,并在培养基中获得分泌的重组凝乳酶原,经过酸处理后凝乳酶原转化为有活性的凝乳酶。o利用乳酸克鲁维酵母LA“整合表达系统成功实现微小毛霉菌凝乳酶的分泌表达。

2.2利用乳酸克鲁维酵母生产乳糖酶乳糖酶广泛来源于动物、植物和微生物,酵母来源的乳糖酶为胞内酶,其最适作用pH偏中性,适用于牛乳和鲜乳清中乳糖的水解[26⒓7]。在乳品工业中主要用于生产低乳糖牛奶、浓缩乳制品等。乳酸克鲁维酵母是目前生产乳糖酶的主要菌种之—。20世纪20年代,乳酸克鲁维酵母乳糖酶已经通过美国食品及药物管理局(FDA)认定为GRAS,同时中国卫生部也在1998年将其列人GB2760中。张萃荟[29]成功筛选出乳酸克鲁维酵母突变株KJ@crzs⒈16刁,该突变株所产β-半乳糖苷酶水解活力达10/龃,具有很高的转糖苷活力,其转糖苷产物为乳果糖,乳果糖产量达轺88酽L,可作为生产乳果糖β-半乳糖苷酶的生产菌株。

2.3利用乳酸克鲁维酵母生产其它酶类应用乳酸克鲁维酵母已经成功实现工业化生产凝乳酶和乳糖酶,且产量大、酶活高、成本低,逐步被市场所接受。近几年,越来越多的蛋白,包括食品酶类在乳酸克鲁维酵母菌体中成功实现表达,为工业化生产奠定了基础。乳酸克鲁维酵母表达载体带有非抗生素筛选标记乙酰胺酶基因(om弱),能够将乙酰胺降解成氨。因为乳酸克鲁维酵母没有能力利用乙酰胺,只有从载体上获得乙酰胺基因而过表达乙酰胺酶的转化细胞才能在以乙酰胺为唯一氮源的琼脂培养基上生长。这种选择方法也为工业生产的安全性提供了保证。朱敬华等:20∶将植物乳杆菌202058中的亚油酸异构酶基因在乳酸克鲁维酵母中进行克隆表达,结果显示,重组酶转化效率约为20%。Ⅲteri“等[3031]通过固定化乳酸克鲁维酵母细胞,以三相系统形式生产葡糖淀粉酶,使酶产量达到0.017U mg/ce11·h。

3展望

至今,利用乳酸克鲁维酵母已经表达了许多外源蛋白,如凝乳酶、葡糖淀粉酶、乳糖酶、木聚糖酶等食品酶类。其具有的营养要求低、生长迅速、可对外源蛋白进行糖基化修饰、遗传背景清楚、表达水平高、表达系统安全、大规模发酵工艺成熟等诸多优点,极有可能在未来成为一种具有产业化优势的酵母表达系统。正因为乳酸克鲁维酵母在表达外源蛋白和发酵工艺方面存在着独特的优势,所以乳酸克鲁维酵母在食品酶制剂领域将显示出巨大的潜力。

参考文献

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