Bacillus subtilis RecQ酶精氨酸突变体表达纯化及活性检测

解旋酶是一类能解开核苷酸双链的酶,它广泛存在于从病毒到人类等多种生物体中。自1976年人类在大肠杆菌中发现了第一个RecQ解旋酶[1],至今已有上百种解旋酶被发现,而且这一酶家族成员还在不断扩大。尽管解旋酶种类繁多,人们在研究过程中发现,这类蛋白酶在其氨基酸序列上有一定的同源性和相似性。分析表明,这些同源序列在进化过程中构成了几个高度保守的区域,这些区域执行不同的酶功能。经过多年的研究,人们发现解旋酶在细胞内具有多种生物功能,它们参与DNA复制、修复、转录重组以及RNA接拼、核糖体组装、蛋白质翻译,甚至是端粒稳定,对维持生物体内遗传物质的生物活性与代谢过程的正常秩序起到了重要作用[2]。

枯草芽孢杆菌系革兰氏阳性细菌,形态简单,具有环状DNA。基因组简单且DNA复制过程中操纵子高度集中,严格控制DNA复制过程。因此枯草芽孢杆菌被公认为研究分子代谢过程的最佳模式生物之一。本文所研究的枯草芽孢杆菌RecQ为DNA解旋酶,与大肠杆菌RecQ相比,该枯草芽孢杆菌RecQ酶虽缺失氨基酸C端HRDC结构域,但实验证明其表现出比大肠杆菌RecQ酶更高的ATP水解活性,更适合作为RecQ酶与ATP相互作用研究的分子模式生物。枯草芽孢杆菌RecQ酶含有解旋酶中的H山caqe co∞保守区域中重要的结构——精氨酸指,位于此结构域的C端,进化保守,并靠近与其结合的ATPγ磷酸位置,该结构有利于RecQ酶对核酸的水解作用[35]。枯草芽孢杆菌RecQ酶的衬醑21和arg323残基位于该酶氨基酸序列Hehcase∞re保守区域的C端,其位置与大肠杆菌R∝Q酶的精氨酸指一致,推测这两个精氨酸残基可能在ATP水解和能量转移中起到重要的作用。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1 质粒和菌种载体pET24a(+),E co九DH5α,E,coJ氵BL21(DE3)均为本实验室保存(天根生化科技有限公司),Bacillus subtilis168购自ATCC(美国)。

1.1.2酶与试剂Pftl高保真酶、蛋白质分子量标准购自Fementas公司。限制性内切酶△oR I,肋oI,⒎连接酶均购自%KaRa大连宝生物工程公司。考马斯亮蓝R-250,IPTG购自北京鼎国生物公司。ATP酶活性检测试剂盒购自英国Inn。Ⅴa B记hc·1ences公司。№-NAT H“Bllld亲和层析柱和填料等购自Nulvagen公司。其他试剂均为国产分析纯。

1,1,3仪器JY92-型超声细胞破碎仪(浙江宁波新芝仪器厂);高度冷冻离心机(美国Therm公司);BoTeksynerg1·H多功能酶标仪(基因有限公司);PTC-1OO PCR扩增仪(美国Bo退ad公司);-20℃冰箱(日本SANYO公司)。114 DNA底物PAGE纯化级DNA底物由上海捷瑞生物工程有限公司合成,其序列和长度(TCAAAGTC ACGACCTAGACACTGCGAGCTCGAA"CACTGGAGTG ACCT)。

1.2方法

1.2.1重组野生型BΩcjJJ仍ss仍3莎JJJs RecQ解旋酶及其突变体基因PCR扩增以召@c氵JJ仍ss汕苫JJJsI68中抽提的基因组DNA为模板,PCR扩增得到大小为15lcb的RecQΞ憝因片亻殳(F:5′-CCGGAATTCATGACTAAATTAC AGCAAACGTTATATCAG-3′,R:5′¨CCGCTCGAGGTTC AGCTCACCTACAGTCTGC3′,下划线部分为EcoR I和肋oI的酶切位点),该PCR扩增产物一部分用于体外野生型蛋白表达,另一部分扩增产物用于突变型构建模板:两个单突变(肥19A和R322A),一个双突变(R~s19/~3”A)。

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本文旨在研究枯草芽孢杆菌RecQ解旋酶的结构与功能之间的关系,目前国内外尚未有相关报道,因此选取研究较多的大肠杆菌的RecQ解旋酶作为阳性对照,其基因序列和晶体结构均已公布在NCBI上,本实验室前期研究工作也证明E.co拓RecQ体外重组原核表达较易,可溶性强且活性高[9]。与大肠杆菌R∝Q比较,枯草芽孢杆菌RecQ也可较好地在体外可溶性原核表达。其虽然缺失氨基酸C端HRDC结构域,但我们通过实验发现其表现出比大肠杆菌RecQ酶更高的ATP水解活性,从而说明Helicase区域可能对于ATP水解起到更重要的作用。由于大肠杆菌RccQ酶具有DNA依赖性和蛋白浓度依赖性[9],因此我们也设计实验来探讨枯草芽孢杆菌RecQ酶是否也具有这样的特性。通过实验发现枯草芽孢杆菌RecQ酶不仅具有DNA依赖性,同时也具有蛋白浓度依赖性。解旋酶的结构是其生化活性的前提,不同保守功能区域分别具有不同的功能,彼此之间相互作用,相互协调,来完成酶的整个运作机制。有研究证明RecQ解旋酶中精氨酸残基负责RecQ酶对ATP水解和结合作用。基于这些理论依据,本文将枯草芽孢杆菌RecQ中位于H山case区域的两个精氨酸残基分别进行单突变和双突变,结果发现突变后的RecQ酶对ATP水解活性明显降低,说明精氨酸可能参与负责ATP的水解功能。为了确定所选的两个精氨酸残基是否为精氨酸指,在后续实验中,我们将用原钒酸盐(Ⅵ)抑制剂来检测枯草芽孢杆菌RecQ解旋酶的精氨酸指,是否为精氨酸指,从而确定枯草芽孢杆菌RecQ精氨酸指的结构构型与其分子作用机制。

在分子机制研究基础上,已经有文献报道大肠杆菌RecQ解旋酶主要参与DNA复制、DNA修复、重组、转录等DNA代谢过程。研究表明大肠杆菌RecQ缺失会影响到DNA重组和修复。与野生型大肠杆菌相比,Rec·Q缺失菌株的菌落大小并未有任何差异。大肠杆菌RecQ解旋酶发生突变后则表现出基因组异常[⒕],并且会增加不合理的重组几率。Hanada等研究结果表明:大肠杆菌RecQ突变菌株较正常菌株对紫外线更为敏感,RecQ突变后能使基因非法同源重组率提升⒛~300倍,此现象与人类RecQ突变后形成染色体异常十分相似。同时在紫外线诱导下,突变株的非法重组将提高约10~100倍。但至今国内外尚未有关于大肠杆菌RecQ精氨酸指突变菌株,枯草杆菌RecQ解旋酶全基因敲除或精氨酸指突变菌株的相关报道。目前我们正在致力于利用基因敲除技术[1b]构建枯草杆菌RecQ解旋酶缺失菌株,从细胞水平上分析RecQ解旋酶对枯草杆菌细胞形态、细胞生长以及修复DNA损伤机制的调控作用。RecQ解旋酶不仅能调控DNA复制过程,在DNA修复过程中也起到了关键的作用。因此对枯草芽孢杆菌RecQ解旋酶结构的解析和与DNA相互作用的研究能帮助我们更深入地了解RecQ解旋酶在分子代谢中的运作机制,揭示生物大分子物质的本质。致谢本文还得到华东师范大学科研创新基金青年项目(78210050)和华东师范大学大型仪器设各开放基金(20135)的资助,特此致谢。

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