5型和35型腺病毒纤毛蛋白的原核表达及活性验证

T细胞对抗原的特异性识别是由其表面的T细胞受体(T∞lheceptor,TCR)决定,将特异性识别抗原的TCR基因导人病人的T细胞,在体外刺激活化后回输体内的过继性治疗,在抗肿瘤与抗病毒等临床应用中有着良好的前景[13j。目前体外基因修饰T细胞的常用载体为逆转录病毒载体[4],但是逆转录病毒因其整合基因组的特性,从生物安全的角度不适于临床应用。腺病毒载体因具有能感染增殖和非增殖细胞、不整合宿主细胞基因组、能同时表达多个外源基因等优点,已逐渐在TCR基因修饰的T细胞过继治疗中发挥重要作用[5]。有关腺病毒载体感染T细胞的分子机制研究,可为用于临床治疗的腺病毒载体研发提供理论基础。

腺病毒的纤毛由尾巴(tail)、杆(shaft)、头节(kllob)3部分组成,在感染细胞过程中发挥重要的作用,腺病毒感染细胞的过程开始于纤毛的头节结合细胞表面的特异性受体,不同血清型的腺病毒所识别的细胞表面受体存在较大差异[61。目前最常用的腺病毒载体是血清型5型腺病毒(Ad~s),其感染细胞表面天然受体为柯萨奇受体(cc,xsache leceptor,CAR)[6]。T淋巴细胞因柯萨奇受体(CAR)表达水平低,导致5型腺病毒载体转染T细胞效率较低[7]。35型腺病毒结合细胞的天然受体为CD46,Cy6分子在T淋巴细胞中有较高水平表达。因此将5型腺病毒中编码纤毛头节和杆区部分的基因进行替换重组,形成具有35型腺病毒纤毛杆和头节的嵌合型腺病毒载体A凼F35,该病毒保留A凼的所有特性,通过结合细胞表面的CM6分子感染细胞,能够明显提高病毒转染T淋巴细胞效率[9]。Ad5er基因编码区长度为588个碱基,编码蛋白为1%个氨基酸;Ad35Rber基因编码区长度为阴0个碱基,编码蛋白为280个氨基酸。本文通过原核表达、纯化5型(Ads)和35型(Ad~15)腺病毒纤毛蛋白,通过纤毛蛋白竞争性抑制病毒感染实验,验证所表达纤毛蛋白的活性,为下一步通过免疫共沉淀方法研究AF35感染细胞的机制奠定基础。

1材料与方法

1.1材料

Jurkat细胞(T淋巴瘤细胞株)为本实验室保存,293细胞购自美国菌种保藏中心,原核表达载体pET 28a购自Nclvagen公司,骨架载体pBHGloxdelE1,3、穿梭载体pD∞15购自Mrbk公司,All~o^B5骨架载体为实验室构建,BCA蛋白浓度测定试剂盒购自碧云天生物科技公司,IPTG、各种限制性内切酶、DNA琼脂糖凝胶回收试剂盒、DNA连接酶购自TaKaRa公司,N12+NTA凝胶珠购自Them。Fisller公司,无血清1640培养基、胎牛血清、阳离子脂质体购自αbc·o公司;TC-C18反相柱购自A驴lent公司;高效液相系统(HPLC)为Waters公司产品,流式细胞仪Epics-ⅩL购自Beckman Cclulter公司。

1.2方法

1.2.1细胞培养37℃条件下,在5%CO2培养箱中用1640完全培养液(补加10%新生牛血清、2m。l/L谷氨酸)培养Jtlrk蔽细胞。

1,2.2病毒包装实验中用到的两种腺病毒Ad5-GFP和Acl~sF35GFP均为本实验室包装,这两种病毒的基因组上带有GFP基因的表达盒,病毒感染细胞后可在细胞内表达GFP蛋白。病毒包装采用Mic∞bk公司细胞内同源重组的AdM沤系统,具体步骤可参考文献[10],大致步骤如下:(1)将重组载体pDC315-GFP与A“骨架载体pBHGbxdelE1,3通过阳离子脂质体转染293细胞。(2)将重组载体pD∞15GFP与AtlDB5骨架载体通过阳离子脂质体转染⒛3细胞。(3)载体转染后12天通过显微镜观察病斑的出现。(4)通过TCID50法测病毒滴度。

1.2.3 Ad5和Ad35纤毛基因的扩增以载体pBHGl°xdelE1,3为模板,PCR扩增Ad5伍ber片段;以Ad5B5骨架载体为模板,PCR扩增Ad35Ⅱber片段。设计引物时,两端加EcoRI、尻zldⅡI酶切位点(表1),扩增条件:%℃45s,58℃30s,”℃1min,30个循环。反应结束后,扩增产物于12%A驷ro凝胶电泳。扩增产物经DNA琼脂糖凝胶回收试剂盒提纯后,经EcoR I和尻ndⅡI限制性内切酶酶切,与经EcoR I和JJl乃dⅢ酶切后的原核表达载体pET-28a连接;转化DH5α感受态细胞,卡纳抗性筛选阳性克隆;扩大培养阳性克隆,经菌落PCR初步验证后,将候选重组载体送Ill访trogen公司测序进一步验证直至Ad5sber和Ad35 sber基因重组表达载体构建成功.

1.2,4 Ad5和Ad35纤毛蛋白的表达与纯化将测序正确的重组载体pEa-Ad5sber和p8a-Ad35er转入大肠杆菌B⒓1(DE3)的感受态细胞中,37℃,250〃min摇床培养至oD60。值为0.6;加人IPTG至终浓度为0.1mmol/L,37℃下继续诱导培养3h;收集细胞沉淀,将沉淀用501nl的裂解缓冲液(50mmoL/L Ths△Cl pH8,0,1OO mmol/L NaCl,5%甘油,5mm。l/Lβ-巯基乙醇,1血mol/L咪唑)充分重悬;用超声波将细胞充分破碎,16∞0g,4℃离心30m血,取上清;加人Ni剁TA凝胶珠311al,室温下放置1h;以~sO0g离心5血n,弃上清;用10倍凝胶珠体积的洗涤缓冲液(50mmol/LT⒒s-HCl pH8,0,100mmol/L NaCl,5%E+油,5mm。l/Lβ-巯基乙醇,50mmd/L咪唑)洗涤3次;加人2倍凝胶珠体积的洗脱缓冲液(50mmol/L Ths¨HαpH8.0,100 mmol/L NaCl,5%△油,5mm。l/Lβ-巯基乙醇,500 mmol/L咪唑)洗脱;收集洗脱的上清,每个样品重复上样3次,每次上样10淤,HPLC柱采用TC-C18(4,6×1~sO mm,粒径5um,A妙lent),检测波长犭4nm,流速1 ml/min,流动相A乙腈,流动相B水溶液,洗脱条件采用线性梯度洗脱9D^%B到10%B持续100min。12.5蛋白浓度测定按∞体积BCA试剂A加1体积BCA试剂B配制适量BCA工作液,充分混匀;完全溶解蛋白标准品,取10、△l稀释至100淤,使终浓度为0,5mbc//llll。将标准品按0,1,2,4,8,12,16,,20d加到%孔板的标准品孔中,将用于稀释标准品的溶液补足到⒛ltl;加适当体积样品到%孔板的样品孔中,加用于稀释标准品的溶液到⒛ul;各孔加入⒛0d BCA工作液,37℃放置30m血;测定562nm波长的光吸收值;根据标准曲线计算出蛋白浓度。126病毒感染细胞以⊥640完全培养液重悬Jtllk乱细胞,按照5×105/孔密度接种于6孔细胞培养板;按照终浓度0ug/llll,01ug/llll,1ug/llll,10ug/llll,.0ug/llll分别加人重组蛋白A沁丘ber和Acl35flbel,室温孵育~sO min;以感染复数(muhiplichy of in壬ocuon,MOI)MOI=1OO分别加人腺病毒Ad5GFP,Ad5"5-GFP,置于细胞培养箱内培养1h;以⑽0g离心5血n,弃上清;加人1640完全培养液,置于细胞培养箱内培养24h;流式细胞仪检测表达GFP的阳性细胞比例。

2结果

2.1 A峦Ⅱber基因和Ads5Ⅱber基因的克隆Ad5flber基因编码区长度为588个碱基,加上引物携带的18个碱基的酶切位点及保护碱基序列,扩增产物理论长度为∞6个碱基;Acl~35ber基因编码区长度为泓0个碱基,加上引物上携带的18个碱基的酶切位点及保护碱基序列,扩增产物理论长度为甾8个碱基。PCR扩增Ad35lDer和Ad5Ⅱber基因片段的结果见图1,在大约850bp处和600bl,处获得条带,与预期大小相符合G2.2 AdsⅡber蛋白蛋白的表达与纯化本实验中使用的原核表达载体为pET-28a,Ad15丘b∝蛋白的分子量为315kDa,加上多克隆位点表达的34个氨基酸,预期大小为352kDa的融合蛋白,Ad5仙α蛋白的分子量,3kDa,加上多克隆位点表达的30个氨基酸,预期大小为笳kDa的融合蛋白。图2为12%SDS2AGE分析诱导表达的hlsRber蛋白和hisd35ber,与推测的大小一致。在上清液中均能检测到两种重组蛋白的表达,其中hs从dD^RlDer重组蛋白检测出在上清液中表达水平较高。500mmol/L咪唑浓度下洗脱所需的融合蛋白经HPLC分析,丘lDer蛋白和Ad35sbα蛋白主峰纯度大于⒇%(图3)。

3讨论

本文成功构建病毒纤毛原核表达载体,并在大肠杆菌中成功表达纤毛蛋白,形成带有⒍his的融合蛋白.在细胞上清与细胞沉淀中均检测出目的蛋白,降低诱导时间及诱导温度可能会提高其可溶性表达的比例。预先将AdDilDer蛋白与细胞孵育,明显抑制A山对细胞的感染,并且抑制的效果与Ad5ber蛋白的使用量成正比,对Ads Fs5的感染无影响;将Ad~35丘ber蛋白预先加入细胞,可以抑制Ad5F35对细胞的感染,并且抑制的效果与Ad35ber蛋白的使用量成正比,对A山的感染无影响,表明本文所表达的两种融合纤毛蛋白均具有生物活性,能与细胞表面受体成功结合。应用分子生物学的方法将A山纤毛的头节区和杆区替换成Ad35的部分,形成嵌合型腺病毒载体AF35,从而改变病毒结合细胞的受体,已成功提高病毒转染T细胞的效率[9]。然而以往实验发现,A山Fs5转染T细胞的效率与细胞表面CM6的表达高低并无明显关联,并且应用CD46的抗体只能部分阻断Ad5F35对细胞的转染。我们推测除CD46以外,还存在其他未知的细胞表面分子可以与A甾F35结合,实现病毒对细胞的感染。因此,发现并验证病毒Ad5F35与细胞结合的新受体,确认新受体与已知CD46受体在Ad~sB5病毒感染细胞中是否存在协同关系,以及对病毒通过该受体进人细胞后的胞内运输途径进行深人的研究,将为腺病毒Ad~sF35感染细胞的分子机制研究提供有益补充。接下来我们欲提取细胞膜蛋白,与具有活性的重组纤毛蛋白孵育,筛选并验证能与病毒纤毛结合的细胞表面分子,为研究Ads F35感染细胞的机制提供可能,也为进一步研发临床治疗用途的腺病毒载体奠定基础。

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