经典Wnt信号途径在肺脏上皮细胞抗结核分枝杆菌感染中的作用

结核病是由结核分枝杆菌(Mtb)感染引起的一种严重危害人类健康的慢性传染性疾病。Mtb为典型的胞内寄生菌,进人宿主以后,机体可以通过肺泡巨噬细胞吞噬作用对其感染激发一系列的免疫反应。最近研究表明,肺脏上皮细胞在肺脏免疫中发挥着重要作用,它不但是抵抗外来物人侵的第一道防线,而且与巨噬细胞一样,也具备吞噬Mtb的功能,并且在肺脏免疫中担负着由先天免疫到获得性免疫中的桥梁作用。

研究表明,Wnt信号蛋白家族在器官发育,特别是肺脏形态发育中是一个活跃的信号转导通路。Wnt信号包括经典途径和非经典途径,其Wnt/β-cate血n经典信号途径与许多疾病的发生都有相关,在肺脏疾病中以肺癌和肺纤维化研究最为广泛[34]。最近在肺脏抗结核的免疫机制研究中发现,Wnt信号途径在肺泡巨噬细胞抗Mtb感染中具有免疫调控作用,这表明,Wnt信号在结核免疫中存在调控作用[5⒙],但是,关于肺泡上皮细胞在肺脏抵抗Mtb入侵中Wnt经典信号通路的免疫调控作用尚未见到报道。因此,本研究拟通过牛结核分枝杆菌(bacⅡlus calmette-GueⅡn,BCG,卡介苗)感染人肺脏上皮细胞A549,分析其经典Wnt信号通路相关蛋白信号和细胞因子的变化,揭示Wnt经典信号通路在肺脏上皮细胞抗结核分枝杆菌免疫调控的分子机制,为进一步研究肺脏上皮细胞抗Mtb感染的免疫调控作用奠定理论基础。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1细胞系与抗体人肺脏上皮细胞肺腺癌A549细胞系购自中科院上海细胞所,所用抗体见表1。

1.1.2试剂与载体试验中所用的试剂有RPMI1640基础培养基(Hyclone)、胎牛血清(FBS)(Hyclone)、o±ectamin LTX⑧&PLUSTM(Invitr。gen)和WesternBright ECL(GEHe龃thcare)等;所用试剂盒包括双荧光素酶检测试剂盒(Pr,mega)、质粒提取试剂盒(TIANGEN)、核蛋白提取试剂盒、BCA蛋白定量试剂盒(凯基生物公司),人TNF-α和IL-6ELISA试剂盒(深圳欣博盛生物公司);其它化学试剂均购于西安国安生物科技有限公司。载体为荧光素酶Wnt信号报告载{本BATΠash(Addgene,USA)、pcDNA3.1(Invir。gene,UsA)禾口β-catenin(Addgene,uSA)。

1.2方法

121 A549细胞培养、转染和BCG感染将A549细胞系培养于含10%胎牛血清、100IU/llll青霉素及100 IU/llll链霉素的RPMH“0培养液的6孔板中,培养条件为5%C02,饱和湿度。待细胞生长到ω%~⑽%融合密度时,按照试剂盒说明,利用Lo

ctamine LTⅩ将BATnash和对照质粒pcDNA3.1或β℃耐enin的真核表达质粒分别共转染到细胞中,转染h后,按感染滴度(MOI)为3(3CFU/cell)的BCG感染细胞,勿h后,收集细胞培养上清液,10OO01/lllln,离心5雨n,保存于-80℃,用于ELISA分析;收集细胞,按照相关蛋白提取试剂盒使用说明分别提取总蛋白、胞浆蛋白和细胞核蛋白组分,用于Western blot分析。

1.2,2双荧光素酶检测将A549细胞培养于12孔板中,按1,2.1中的组合方法转染细胞后培养舛h,然后用BCG感染⒛h,PBS漂洗3次,按双荧光素酶检测试剂盒说明,用荧光发光检测仪检测双荧光素酶活性,记录数据并进行统计分析。均一后的萤火虫荧光素酶活性为Wnt信号报告基因指标,结果与pcDNA3.1对照组比较,判断Wnt信号的变化。123 ELISA分析按照人TNF¨α和IL-6ELISA检测试剂盒说明检测收集到的细胞上清液中的TNF-α和IL‘,根据标准曲线,计算出TNRα和IL‘的含量。12,4 We哎em bl⒍分析将提取的细胞总蛋白、胞浆蛋白及细胞核蛋白在测定总蛋白浓度后,调整蛋白浓度,使每孔上样量一致,然后进行10%SDS屮AGE凝胶电泳,电转移至PVDF膜后,以5%脱脂奶粉室温封闭2h;加入合适稀释的表1中的特异一抗,4℃过夜孵育,次日平衡到室温后PB叩漂洗3×10min后,加辣根过氧化物酶(POD)标记的相应二抗,室温孵育1.5h,漂洗后用ECL底物显色,X-光片曝光显影,测定目的蛋白条带灰度值,实验组与对照组灰度值相比,得相对表达量,以此来分析目的蛋白的表达情况。

2结果

2.1 BCG感染抑制上皮细胞中经典Wnt信号活性与对照组相比,过表达β-cate血n的A549细胞荧光素酶活性升高了约2倍;在BCG刺激过后,对照组的荧光素酶活性降低了近⒛倍,而过表达β-catenin的细胞荧光素酶活性恢复到与对照组相似的水平,差异不显著(P(0.∞)。结果表明,BCG感染对A549细胞中Wnt信号经典途径具有抑制作用(图1)。

2.2 BCG感染对A549细胞中Wnt信号家族相关蛋白表达的影响经Western-blot分析发现,在BCG感染后”细胞内β-cate“n蛋白表达的总水平没有明显变化,但胞浆内易于被泛素降解的磷酸化β-catellln蛋白量增加,Wnt信号抑制因子驴yc岵en盯nthase hnase3beta(GSK3β)和Axis inhibition protein(Axin2)蛋白表达上调(图2);而细胞核内活性β-catenin(activeβ-catenin)及其下游转录因子TCM(T cell兔ctor砰)和Lef~1(ˇmphoid enhancer¨binding hctor-1)的表达量发生下调(图3)。上述结果表明,BCG感染可通过改变A549细胞中的Wrlt信号活性来激活细胞免疫应答反应。

2.3 BCG感染对AM9细胞中TLR信号与炎症因子的影响在BCG感染A549细胞后,细胞内Wnt信号活性下调,那么Wnt信号活性变化是否影响细胞对BCG的免疫学反应呢?Westem blot和ELISA分析结果发现,“翎细胞在感染BCG后,除TNF-α外,TLR信号接头蛋白MyD88和其下游信号TRA、NF KB,及炎症因子IL葡的蛋白表达水平都显著升高(图4、5);当细胞过表达β-catenin时,未感染BCG的细胞中TNFα分泌(图5)和细胞浆NF-KB未发生变化,MyD88的表达都发生下调(图4),而TRAF6(图4)和IL‘(图5)的表达显著升高。值得注意的是,这时细胞核中N⒎KB的表达却被βcate血n有效抑制(图4);而当BCG感染过表达β-catenin的细胞时,β-mtenin可以部分抑制BCG诱导的MyD88、TRAF6、NF-κB(图4)和IL-6的表达(图5)。这些结果表明,Wnt信号的激活可能通过TLPo/MyD8VTRAF6信号途径抑制了肺脏上皮细胞对BCG感染的免疫反应。

3讨论

Wnt经典信号通路即Wnt/β-cate砬n通路,是Wnt信号中研究最清楚的一条通路.在该通路模型中,Wnt配体与细胞表面F五zzled受体家族、LR乃/6和D“hevel1ed(DSH)结合,形成Wnt受体复合物,该复合物激活后,可以抑制其下游A茹l·/GSK~3/APC蛋白复合体的形成,从而使胞浆内的β-cate血n稳定存在,并在胞浆聚积,胞浆内浓度β-cate血n的增高可和去磷酸化的活性β-catenin(activeβ-catenin)进人细胞核,与转录因子TCF/LEF作用,并促进特定基因的表达。相反,当细胞夕卜缺失Wnt信号时,A蛀〃GS(3/APC复合体大量形成,促进β-c敲e“n磷酸化而被泛素降解,导致细胞内β-c乱enlll浓度的下降,抑制Wnt信号目的基因表达。Neumann等[9]最近研究小鼠体内肺脏巨噬细胞感染BCG发现,BCG能够在体内外抑制肺脏臣噬细胞的β-catellln表达水平,过表达Wnt3A(经典Wnt信号途径配体)可激发细胞β-cate血n表达,抑制BCG激活的TLR/MyD8V NF-KB炎症信号通路。

本研究发现BCG感染肺脏上皮细胞,也导致细胞Wnt信号活性降低,包括细胞核活性β-cate血n蛋白组分下调,细胞浆中形成降解β-∞tenin的蛋白复合体主要蛋白GSK-3β和Axin2等,Wnt信号反馈调节抑制子的表达增高,这与巨噬细胞中的发现一致。BAT nash wnt信号报告质粒的x⒊amos最小启动子上游含有7x TCF结合位点,而下游为荧光素酶报告基因。串联的TCF结合位点可以特异结合Wnt信号经典Wnt途径的效应子β-caten从而特异激活启动子驱使荧光素酶基因的表达,所以该报告载体被广泛用于细胞内Wnt经典信号途径的分析[ll],wnt报告基因BAFΠash双荧光素酶分析结果也证实BCG感染细胞时Wnt信号被抑制。当细胞过表达β-caten血时,其荧光素酶活性只比空白组升高2倍,这可能是由于A549细胞为肿瘤细胞,其内源性Wnt信号处于活化状态[⒓l,这种高内源性的Wnt信号活性,在BCG刺激后被显著地抑制c在研究感染性休克模型和小鼠感染BCG模型中发现,通过过表达Wnt3a或GsK3β抑制剂提高Wnt信号的小鼠能够在感染结核分枝杆菌中迅速地发挥抗炎性效果,这个过程可能与活化Wn'βcatenh信号,产生Fzd1受体有关[9’:]。这些结果表明,Wn'βCate而n通路在抑制炎性细胞因子表达中发挥着反馈调节作用,从而限制炎症反应的过度活化。本研究也发现肺脏上皮细胞中过表达β-cate血n能抑制细胞中TLR信号通路接头蛋白MyD88和其下游细胞核NF KB的表达;降低BCG感染诱导的TLR信号活性和炎症反应因子,包括MyD88、TRAF6、NF-KB和IL-6产生,从而减轻炎症反应。综上所述,本研究结果表明,BCG感染抑制肺脏上皮细胞中的经典Wnt/βcatellln信号通路的活性,进而通过降低TLR/MyD88/TRAF6/NF-KB通路的活性来负反馈调节宿主细胞的免疫学反应,这为进一步研究肺脏上皮细胞抗结核的免疫调控作用奠定理论基础。

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