新疆地区汉族、维吾尔族先天性巨结肠患儿组织蛋白酶D与S-100的表达及其意义

先天性巨结肠(hirschsprung’s disease,HD)又称肠无神经节细胞症,是一种神经峭源性疾病和多基因遗传病,其发病率为1/50O0,在小儿胃肠道先天性畸形中居第2位,男女发生之比为4:1,主要病理改变是远端病变段肠管神经节细胞缺如L1J,以致受累肠段异常收缩,其近端结肠代偿性扩张与肥厚,形成巨结肠。随着分子遗传学的发展,人们对先天性巨结肠的发病机制有了进一步的了解,研究发现CAD、⒊100可作为观察神经节细胞的指标,对HD的诊断及预后评估有较大的帮助[2]。本课题通过检测CAD、⒊100的表达结果、分布特点,探讨其在汉族、维吾尔族先天性巨结肠患儿之间的表达及其意义。

1资料与方法

1.1研究对象选择新疆乌鲁木齐市儿童医院2004年1月一2010年10月收治的先天性巨结肠患者45例标本,所有病例术后均经常规病理检查确诊为HD。其中维吾尔族患者20例,汉族25例,男性42例,女性3例,年龄4d~9岁。每例标本分别取近端扩张段切缘肠壁作为HD扩张段组,取远端狭窄段肠壁作为HD狭窄段组。另收集20例HD近端切缘正常肠壁冰冻切片剩余组织(正常冰冻组织)作为对照组。

1.2试剂及检测方法所有标本经10%甲醛固定、石蜡包埋、连续切片(片厚4um)、脱蜡后进行免疫组织化学染色。CAD抗体为中杉公司产品(产品编号:ZM0033,即用型),⒏100抗体(产品编号:MABo585,即用型)与二抗试剂盒等均为福州迈新公司产品。抗原采用高压法修复,染色步骤采用⒏P法,用已知阳性染色的结肠癌切片为阳性对照片,用PBS代替一抗作阴性对照。观察并计数肠壁神经丛内神经节细胞、神经纤维及神经鞘膜细胞的染色情况。

1.3结果判断棕黄色为阳性信号,CAD、⒏100的阳性表达部位均位于细胞质。观察指标以“++”、“+”、“—”表达染色的深浅。阴性染色为“—”,弱阳性染色为“+”,阳性染色为“++”。

1.4统计学处理采用SPsS12,0软件包进行统计学处理,采用√检验,以P<0,05为差异有统计学意义。

2结果

2.1 HD扩张段肠壁肌间与黏膜下层神经丛中可见CAD阳性染色的细胞状棕黄色颗粒(图1),经与HE切片对比后证实为神经节细胞的胞浆。神经节细胞的染色强度不同,肌间神经丛内神经节细胞着色强于黏膜下神经丛。神经丛中神经纤维和神经鞘膜细胞中CAD均为阴性染色。在黏膜和黏膜下层中有散在组织细胞,CAD呈弱阳性染色。⒏100在神经丛中神经纤维和神经鞘膜细胞表达均为阳性染色,在阳性染色的神经丛中可以观察到一种特征性形态,表现为深染的神经丛中有细胞状“空白区”(图2)。经与HE及CAD染色切片对照后发现细胞状“空白区”总是出现在神经节细胞的位置。

2.2 HD狭窄段肠壁神经丛内缺乏CAD阳性染色神经细胞或神经纤维(图3)。肠壁各层均可见⒊100强阳性的神经纤维束显著增生,形态扭曲呈波浪状。肠壁肌间与黏膜下层神经丛内均未观察到细胞状“空白区”(图4)。

2.3正常冰冻组织CAD与⒏100的表达同HD扩张段。

2.4 CAD、⒊100在各组中的表达及民族间的关系汉族先天性巨结肠患儿CAD、⒏100与维吾尔族先天性巨结肠患儿CAD、⒏100表达比较差异均无统计学意义(P)0.05),见表1。

2.5 HD扩张段组和HD狭窄段组肠壁神经组织对CAD、S-100表达情况在HD扩张段和近端切缘的正常肠壁冰冻剩余组织的肠壁肌间和黏膜下层神经丛中神经节细胞CAD呈阳性表达,在神经纤维与神经鞘膜细胞均不表达。⒏100在神经纤维与神经鞘膜细胞均阳性表达,神经节细胞阴性表达,见表2。

3讨论

HD在小儿胃肠道先天性畸形中发病率较高,确诊依据是远端病变肠壁肌间与黏膜下层神经节细胞缺如。但是在神经嵴细胞的迁移、增生和发育的过程中,受多种因素的影响,神经节细胞可能完全没发育,也可能是发育不成熟L3刽。尤其在新生儿期,这种发育不成熟的神经节细胞更常见,其在光镜下的形态与神经丛中的鞘膜细胞及周围细胞不易鉴别,容易造成误诊。借助酶组织化学和免疫组织化学染色方法可以帮助诊断,但酶组织化学方法染色结果不稳定,容易出现假阳性,需要有经验的病理医师对染色结果做出正确的判断。已有学者采用免疫组织化学染色标记神经节细胞,选择特异性较强的抗体,对HD明确诊断有较好的帮助。

CAD是一种天冬氨酸酶,属于溶酶体酸性蛋白酶家族,其在细胞内蛋白质的分解代谢中起着关键作用,可催化许多神经肽的降解,如P物质、生长抑素、B脂蛋白和血管紧张素原。由于CAD在人类脑组织神经元、体内神经节细胞中含量丰富,故可作为肠壁神经节细胞的标记H。本研究结果显示,在结肠壁中,CAD的免疫反应性仅局限于神经节细胞,神经纤维和神经鞘膜细胞中均不表达。本研究45例汉族与维吾尔族HD患儿狭窄段肠壁全部缺乏CAD阳′l±表达,而45例汉族与维吾尔族HD患儿扩张段肠壁均可见CAD染色阳性的神经节细胞,说明CAD对神经节细胞具有较高的特异性表达,与文献E4-5彐CAD在汉族与维吾尔族HD患儿扩张段与狭窄段肠壁中的表达未见差异,可以证实汉族与维吾尔族HD的肠壁的病变特点是一致的,但发病机制是否相同有待进一步的研究。

组织学研究已经证明,正常人的肠内神经节细胞数目出生后已固定,但有一个成熟过程,即随着年龄增长,大而成熟的神经节细胞数目逐渐增多,不成熟的神经节细胞数目减少。本研究发现,虽然神经节细胞CAD均呈阳性表达,但不同部位的阳性染色程度不一致,表现为神经节细胞胞质中棕黄色颗粒物数量与颜色深度均存在差异,肌间神经丛内神经节细胞染色一般强于黏膜下神经丛。比较HE切片与CAD染色切片还发现,在HE切片中观察到的细胞核大、细胞质丰富的神经节细胞表达CAD较强,而细胞核小、细胞质较少或不明显的神经节细胞对CAD的表达相对较弱。这可能与神经元发育不成熟或发育不良有关。也可以说明染色深浅不同的神经节细胞其成熟程度不同,成熟的神经节细胞染色较深。囚此,CAD不仅可以作为神经节细胞的特异性标记物,还可以检测肠道神经系统中神经节细胞的成熟程度,可作为对临床预后情况评估的指标。对于手术扩张段近端切缘中无CAD表达或神经节细胞CAD阳性表达程度较弱的病例,应该密切观察,以免术后并发肠神经发育不良症引起肠梗阻。

S-100是一组可溶性、相对低分子质量、高酸性蛋白,属神经胶质细胞特异性蛋白,亦可存在于神经纤维中。在研究肠神经系统的形态特征及结构特征中,⒏100有良好的表达功能。国内学者陈卫坚等E21研究发现,⒏100染色中出现的细胞状“空白区”是神经节细胞的特征性表现,可作为观察神经节细胞的指标之一。本研究中45例汉族与维吾尔族HD患儿扩张段肠壁肌间和黏膜下层均可见⒏100阳±染色的神经纤维丛中有细胞状“空白区”,与HE切片比较后发现,细胞状“空白区”总是出现在神经节细胞所处的位置。在45例汉族与维吾尔族HD患儿狭窄段肠壁的肌间和黏膜下层中均未观察到⒊100染色细胞状“空白区”。S10O在汉族和维吾尔族HD患儿肠壁中的表达未见差异。

本组在所有标本的黏膜层和黏膜下层可看到少数CAD弱阳性表达的细胞散在分布。虽然组织细胞对CAD也为阳性表达,但组织细胞与神经节细胞不难鉴别:(1)组织细胞常有长而扭曲的细胞核,缺乏明显的核仁;神经节细胞核大而圆似“枭眼状”,核仁清晰。(2)组织细胞常单个存在或与淋巴细胞同时出现,远离神经丛和神经纤维。目前对神经纤维束异常增生的原因还不完全清楚,陈卫坚等[纠认为异常增生的神经纤维束可能来自肠壁外的神经组织:虽然这些异常增生的神经纤维束对HD不具诊断性意义,但是如果在病变肠壁的肌间或黏膜下层都找不到这种扭曲粗大的神经纤维束,则诊断HD应该慎重。

综上所述,CAD是肠神经节细胞特异性较高的标志物,对不同成熟程度的神经节细胞表达强度不同,不仅可以作为神经节细胞的特异性标记,而且可以判断神经节细胞的成熟程度,用于评估预后。10O对神经节细胞阴性表达可以形成具有特征性的细胞状“空白区”,可与CAD的阳性表达进行对比观察,因此两种抗体的联合应用对HD的诊断有较大的帮助,对临床疾病的诊断及预后具有重要意义。

参考文献:

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