维吾尔医异常体液分型支气管哮喘患者肠道菌群多样性变化研究

维吾尔医(维医)对哮喘的认识历史悠久,理论丰富,遵循辩证理念,注重整体变化为特点,将哮喘病辩证分型诊疗。近年来,在防治哮喘方面维吾尔医药表现出了极大的优势和特色,趋向于个性化治疗的理念[13]。支气管哮喘(哮喘)是一种以气道变应性炎症和气道高反应性为特征的慢性炎症性疾病。迄今,哮喘病已逐渐转变成仅次于癌症的世界第二大致死和致残疾病,成为严重的社会卫生问题。多项研究表明,哮喘等特应性疾病的发生受遗传和环境因素的双重影响,而且与人类肠道中共生的微生物间存在密切联系[1J。生活在人体肠道内的数量庞大、结构复杂的微生物群体参与机体免疫系统的形成、发展与完善,并通过抑制潜在的淋巴细胞反应维系免疫耐受,调节机体Th1与Th2免疫反应平衡,其作用至关重要,可能会成为诊疗过敏性疾病的新途径。为深入了解肠道菌群与哮喘病维吾尔医异常体液分型的关系及异常体液形成的部分机制,研究采用病例-对照研究方案,运用非培养的变性梯度凝胶电泳(PCR-DGGE),指纹图谱分子生态学技术手段,分析不同异常体液分型哮喘组和对照组个体暴露于可能危险囚素(或保护因素)频度的差异,了解不同分型哮喘患者的肠道菌群结构的变化特征,观察肠道菌群与哮喘病维吾尔医异常体液分型间存在的联系,为今后哮喘病的维吾尔医诊疗提供新的思路与途径。

1资料与方法

1.1临床资料选择2008年1月-2009年8月新疆医科大学附属医院呼吸科收治的诊断明确的哮喘急性发作期患者共52例(哮喘组),其中男性26例,女性26例,年龄24~70岁,平均51岁,汉族33例(63.46%),维吾尔族19例(36,54%)。异常黑胆质性哮喘组(异黑组)24例,非异常黑胆质性哮喘组(非黑组)28例。考虑到性别与维吾尔医病证分型间无关,故本研究不考虑性别对分型的影响[6]。选取同期医院骨科住院外伤25例患者为对照组,男性12例,女性13例;年龄26~70岁,平均51岁,汉族15例(60.00%),维吾尔族10例(40.00%);无哮喘及其他过敏性疾病史。纳入标准:(1)诊断符合西医哮喘病诊断标准引、维吾尔医异常体液分型标准参照《维吾尔医诊断学》L:]及《支气管哮喘的中维西医诠释》[剑。(2)居住本地10a以上居民;(3)采样前1个月未服用抗生素及导泻药物。(喹)临床检查资料完整。排除标准:(1)过去的3个月内患有严重腹泻(每天水样便≥3次,并持续3d或以上);(2)过去3个月内患有严重便秘(每周排便≤2次,伴有排便困难);(3)过去1个月内使用过抗生素,并持续3d或以上;(4)严重的肝、心、肾功能不全者;(5)合并严重糖尿病急慢性并发症的患者;(6)妊娠期、哺乳期妇女;(7)精神疾病患者。

1.2方法

1.2.1样品采集与处理采集患者人院第1d的新鲜粪便样品4份,20h内无菌厌氧低温保存后转移至70·C冻存备用。粪便样本总DNA提取采用InVitek公司的PSP Spin Stool DNA Plus Kit(In vitek GmbH,Germany)结合bead beater法提取(Biospec Products,Bartlesville,Okla)。提取的总DNA用DNA浓度仪(Amer曲am Pharmacia B⒍tech,USA)测定浓度,并用琼脂糖凝胶电泳检测质量,所有DNA样本保存于一20·C,用于后续分析。

1.2.2粪便优势细菌的16S rRNA基囚V3区的PCR DGGE分析粪便优势细菌的16s rRNA基因V3区的PCR扩增在Thermocycler PCR system(PCR Sp1·lnt,Therm°electr°n,Corp,UK)内进行。引物序列为P2,5′ATTACCGCGGCTGCTGG3′,P3,5′—CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGC—GGGGGCACGGGGGGCCTACGGGAGGCAGCA—G3′。PCR反应体系(25uL)为:0.5U Taq DNA聚合酶(Takara,Dalian,China),1×PCR buffcr(Mg+±1.ee),2mM MgC12引物各10pmoI',4种脱氧核苷酸(dNTP)各200uM和101·bo细菌总DNA作为模板,采用Touch down PCR程序[10J扩增。在第1轮PCR之后将PCR产物稀释10倍后作为新的模板再进行1轮只有5个循环的Rec°ndi0oning PCRLn]。PCR产物浓度测定后用琼脂糖凝胶电泳检测质量后保存于20C用于后续DGGE分析。

使用Bio Rad公司进行变性梯度凝胶电泳(DGGE)。采用8%聚丙烯酰胺凝胶,电泳缓冲液为1×Ths acetat⒍EDTA(TAE,pH8.4),变性梯度范围为27%~50%(100%变性剂对应7mol/L尿素和40%去离子甲酰胺)。电泳在200V电压、6OC条件下运行200min,结束后用SYBR green I(Ohio)染色,于凝胶呈相系统(Uvltec,Cambridge,UK)拍月黑。DGGE凝胶借助凝胶成像分析系统Quantity One(R)涩.4软件(CA)对所有样品的PCR DGGE指纹图谱进行数字化分析处理。

1.3统计学处理将PCR DGGE分析获得的数字化数据应用PAST(ver.1,89)软件进行单变量统计学分析,以DGGE图谱中条带的位置和光密度值的数字化数据计算sllanllclll WiellαllldeX、smpsOll D和Evenness各生物多样性指标,共同反映研究对象肠道菌群结构的多样性特征。数据以均数±标准差(f±s)表示,采用单因素方差分析,P<0,05为差异有统计学意义。用R软件对数字化的PCR DGGE图谱进行多变量主成分分析(PCA)、偏最小二乘法判别分析(PIs DA),以PCR DGGE指纹图谱为自变董,维吾尔医异常体液分型为因变量建立PLS DA模型,经留一法检验评价模型的可靠性,随机挑选n个样本中的⒈l个样本建立一个模型,预测剩余的1个样本的状态,模型预测准确记为1,预测的不准确记为0,将n个样本循环预测1次,计算预报准确率。

2结果

2.1维吾尔医异常体液分型哮喘患者肠道菌PCR-DGGE指纹图谱特征异常黑胆质组与非异常黑胆质哮喘组的DGGE图谱特征相似,均与对照组存在明显差异(图1)。木同研究组的DGGE图谱特征差异主要表现在条带数目及信号强度(密度)的不同,异常黑胆质性哮喘患者的肠道菌DNA条带有8~28条,平均16条,非异常黑胆质性哮喘患者的肠道菌DNA条带有7~31条,平均18条,对照组个体的肠道菌DNA条带有14~36条,平均24条。异常黑胆质哮喘组的肠道菌类群数量低于非异常黑胆质哮喘组,差异无统计学意义,两组的肠道菌类群数量均明显低于对照组,差异有统计学意义(P(0,05)。各组样品条带的粗细、密度即类群分布均匀性也有所不同。

2.2维吾尔医异常体液分型哮喘患者肠道微生物群落的多样性分析3种指标在3组间比较差异有统计学意义(F值分别为11,02、6,71、8.40,P(0.05)。异常黑胆质哮喘组和非异常黑胆质哮喘组肠道菌群Shannon wiener指数,⒊mpson指数和Evenness均匀度指数均低于对照组,差异有统计学意义(P(0.05)。异常黑胆质哮喘组与非异常黑胆质哮喘组肠道菌群各多样性指数比较,差异无统计学意义(表D。

2.3指纹图谱多变量统计分析基于DGGE指纹图谱数字化数据的PCA分析表明异常黑胆质性哮喘组与非异常黑胆质性哮喘组间肠道内优势菌群构成差异明显,两组样本在空间中显现出较明显的分类趋势(图2a)。两者与对照组间存在更为显著的分类。能够区分维吾尔医异常黑胆质性哮喘与非异常黑胆质性哮喘的肠道菌群差异主要体现在PC2和PC3方向,共能解释32%的变异,由哮喘病因素造成的菌群差异主要体现在PC3和PC4方向,共能解释18,3%的变异。用PLS DA对不同维吾尔医异常体液分型样本的16S rRNA基因V3区PCR DGGE图谱进行分析,异常黑胆质哮喘组与非异常黑胆质哮喘组间的差异得到了最大化的体现,明显分为2类(图2b),该PL⒊DA模型用1个PLS因子的预报准确率为70%。

3讨论

肠道菌群与过敏性疾病的相互关系研究日益备受关注,Nich°lson等[12]认为健康人的肠道菌群结构受宿主遗传表型、饮食、年龄、性别等诸多因素的图谱数字化数据的PCA分析表明异常黑胆质性哮喘组与非异常黑胆质性哮喘组间肠道内优势菌群构成差异明显,两组样本在空间中显现出较明显的分类趋势(图2a)。两者与对照组间存在更为显著的分类。能够区分维吾尔医异常黑胆质性哮喘与非异常黑胆质性哮喘的肠道菌群差异主要体现在PC2和PC3方向,共能解释32%的变异,由哮喘病因素造成的菌群差异主要体现在PC3和PC4方向,共能解释18,3%的变异。用PLS DA对不同维吾尔医异常体液分型样本的16S rRNA基因V3区PCR DGGE图谱进行分析,异常黑胆质哮喘组与非异常黑胆质哮喘组间的差异得到了最大化的体现,明显分为2类(图2b),该PL⒊DA模型用1个PLS因子的预报准确率为70%。表1各组肠道菌群多样性比较(丌±s)组别Shannon H⒏mpson1_D Evenness eH/S对照组异黑哮喘组非黑哮喘组F值P值注:与对照组比较,P<0.05。铲畲影响;疾病、药物也能够显著改变肠道菌群的结构和活性。

通过改变饮食习惯、合理膳食结构及益生菌干预等途径改变肠遁中“有益菌”和“有害菌”比例、纠正肠道菌群失衡将在今后哮喘等过敏性疾病的诊疗和机制研究中发挥重要作用。因此将肠道菌群的分析引人到具有个性化治疗理念的维吾尔医异常体液分型疾病治疗研究中,以期为今后哮喘病的维吾尔医诊疗提供新的思路与途径。本研究以非培养的分子生态学方法一PCR DGGE指纹图谱技术为分析手段,对维吾尔医异常体液分型哮喘患者进行了肠道菌群结构的初步分析研究。PCR DGGE图谱技术突破了传统的菌种分离培养技术的限制,通过核酸信息对微生物群落进行表征的快速、准确的特点使其在研究微生物群落的遗传多样性和种群差异方面具有明显优势。在DGGE图谱中,每一个泳道的条带数目代表个体拥有的微生物类群数量,条带的信号强度(密度)则代表该类群种属的丰富度,密度越大、条带越粗黑则说明该优势种属的数量越多。本研究PCR DGGE图谱很直观地显示出每个样品的DNA条带数量及分布的均匀性,表明异常黑胆质性哮喘组与非异常黑胆质性哮喘组仅从优势菌群数量(条带数量)、种群的丰富度(条带密度)以及多样性指数指标上未表现出明显差异,但与对照组间的差异有统计学意义。

此结果说明哮喘病患者的肠道菌群在DNA水平上发生了明显的改变,每个个体都具有自身独特的指纹图谱特征,个体间的共有条带和特有条带造成了较大的个体差异。生物群落的多样性主要表现在种类数目的丰富度和种类中个体分布上的均匀性两方面。异常黑胆质性哮喘组肠道菌群的多样性略低于非异常黑胆质性哮喘组,两组患者的肠道菌群的多样性分别明显低于对照组,以Shannon多样性指数降低最为明显(P=0.00)。生物的多样性指标既描述类群的数目,又描述种类中个体分配上的均匀性,可以呈现生物多样性的现况、趋势以及各种过程与活动对生物多样性的影响,指标所提供的信息具有重要的参考价值,可以作为预警、决策引导及改善策略的依据。本研究结果表明肠道菌类群多样性降低与哮喘病发病有关,与维吾尔医异常体液分型关系不明显。

PCA、PL⒊DA都属于多变量统计分析方法,是分子生态学研究中较为常用的、有效的数据信息挖掘手段,可弥补相似性聚类分析方法容易受无关因素干扰的缺点,常用作样品的分类与生物标记物的识别[13彐。肠道菌群的功能决定于其结构组成,本研究在PCA无监督分析的分类图中,3组间明显的聚类分离,证明同为哮喘病的不同维吾尔医异常体液分型患者的肠道菌群结构发生了显著改变,呈现较明显的分离,表明肠道菌群在分子水平上发生了显著改变。PLS DA根据样品信息构建的预测模型的判别分析结果与PCA的分析结论一致,提示维吾尔医异常体液形成与肠道菌群结构改变关系密切。相关代谢组学研究已证实维吾尔医异常黑胆质性哮喘患者代谢表型发生了显著变异,并发现了15个表征代谢表型变异的生物标记物[n1。维吾尔医异常体液分型以患者为本,注重机体整体变化特征以及脏腑间的相互关系探寻疾病的演化过程。

肠道菌群是与机体接触最为广泛,关系最为密切的生物群体,能够动态、全面的刻画机体的整体变化特征,反映机体在各种疾病因素扰动下的变化与结果,是不可忽视的生物表征。因此本研究结果为进一步深入了解哮喘病维吾尔医异常体液分型患者的肠道菌群微生态变化及今后的诊疗研究、决策引导提供了重要的信息和实验基础。研究结果同时也显示出PCR DGGE分析手段与PCA、PLs DA多变量统计方法结合仍不失为一种较好的预测性、先行性的分析手段,适合用于菌群结构未知样品的初步了解和研究。后续的研究丁作将有赖于肠道菌群的元基囚组学研究平台,如第二代高通量测序技术进行深度、详尽地分析。

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