纳米羟基磷灰石/聚酰胺66复合膜的结构及与成骨样细胞相容性研究

纳米羟基磷灰石/聚酰胺66复合膜(nHA/PA66)大岜泮孚纳米羟基磷灰石和聚酰胺66采用“常压共溶法”制备而成的复合膜c nHA/PA66在晶体形貌、物相组成、特征基团和离子等物理化学性质上与人股骨皮质骨基本一致,具有较高的仿生性田。其作为骨替代材料已经逐步应用于临床。本实验是将纳米羟基磷灰石(nHA)和聚酰胺66(PA66)按一定比例制各成复合膜,以膨体聚四氟乙烯(e_PTFE)膜为对照,通过光镜和扫描电镜观察两种膜的结构,并在两种膜上接种MG63细胞,同时设立空白对照,观察MG63细胞在膜上的生长情况,探讨nHA/PA仉复合膜作为引导骨再生膜的可行性。

资料和方法

—、主要材料和仪器

膨体聚四氟乙烯膜e-PTFE,上海塑料研究所第一研究室);纳米羟基磷灰石/聚酰氨66复合膜nHA/PA66,四川大学纳米生物材料中心提供);钛圈(宝鸡泰特有色金属有限公司提供);F-12培养液(Gibco.USA);24,96,6孔培养板(USA);超净工作台(SW-臼9F型,苏州安泰空气净化有限公司);扫描电子显微镜(JEOL阝M笱900,日本);Ⅸ70倒置相差显微镜(OLYMPUS,JAPAN);GⅡ.sON加样抢等。

二、膜的准备

nHA/PA弱复合膜,呈白色,厚度1,5mmi e-PTFE膜,白色,厚度1mm。剪裁成直径14mm,3+l11m的圆片,二蒸水漂洗三次,装人玻璃皿中,经高温高压消毒后各用。

三、观察指标

1,膜材料结构观察:将nHⅣPA66复合膜和c-PTFE膜剪裁成25px×25px方片,浸蜡后垂直干切面包埋,制作石蜡切片,厚5um,HE染色,倒置显微镜观察膜横截面的结构,照相。取这两种膜材料,裁成同样大小,真空干燥,喷金,扫描电镜观察膜的表面情况。

2,膜上成骨样细胞生长曲线的测定:将e PTFE膜和nHⅣPA66膜剪裁成直径14mm大小的圆片各12张,消毒后PBS液清洗次,置于20孔培养板内,同时设空白对照组,其上均放置直径14mm的钛圈。培养液浸0ll,使膜贴附于孔板底部,吸净培养液。接种MG63细胞(3×1O+//孑L),标准环境下孵育(37℃,Φ=95%空气+Φ=5%CO2)。分别于1,3,5,7d各取出3孔,采用MTT法,在57Ollm波长下测定每孔的OD值,每组每次取得6孔的数值c求各组平均值,采用双因素方差法分析结果。

3.膜上细胞碱性磷酸酶活性测定:将e~PTFE膜和nHA/PA∞膜剪裁成直径34mn1大小的圆片各⒓张,消毒后PBs液清洗=次,置干6孔培养板内,设空白对照组,其上放置直径约34mm的钛圈c培养液浸dll,使膜贴附于孔板底部,吸净培养液c接种MG63细胞(6×⊥0V孔),标准环境下孵育。常规培养,换液,分别于1,3,5,Tcl各取出3孔,PBS液清洗二次,收集每孔的细胞,在酶联免疫检测仪上测定各孔光吸收值,测定细胞内ALP活力。

4.膜上细胞粘附和增殖的观察:细胞培养同2。分别于Id,5d取出膜片各3个,PBS液反复漂洗2次,3%戊二醛固定,4℃过夜。然后进行梯度脱水,醋酸异戊酯浸泡20分钟,临界点干燥,喷金,扫描电镜观察。

结果

—、膜材料结构观察

1倒置显微镜观察HE染色后e PTFE膜未着色,横截面呈浅灰色,由大小不一的裂隙组成,长约3~5um,宽约15um:裂隙垂直于表面,正反面未兀差别:裂隙间相互联通(图1A)。nHⅣPA⒃膜的横截面结构正面结构疏松,孔隙大小约15Otlm,孔隙相互连通,反面结构光滑致密(图lB)。2,电镜观察:e~PTFE膜平面扫描在2000倍下看到成行排列,直径不一的长椭圆形裂隙,长约5~2Otlm,宽约3um左右,正反面结构基本一致(图2A,图2B)c nHⅣPA∞膜的正面孔隙大小不等,大孔隙约为15OLlm,形态各异。孔隙之间相互连通,大孔隙中也可见颗粒状沉积物。反面表面平滑,可见到较多的微小孔隙,孔径大小约20m,散在分布的一些孔径大小约10um的孔隙,孔隙形状多为圆形,孔隙之间未见到交通(图3A,图3B)。

二、MG63类成骨细胞膜上生长情况

1.细胞增殖曲线的测定:分别于1,3,5,7天测定两种膜组和空白组MTT值,计算其相对时问点上的均值,绘制细胞增殖曲线(表1)c对二组MTT数据进行双囚素方差分析,其细胞增殖量组间无显著性差异,每组在时问点上数据两两比较均有统计学差异(P(0.05),第1天到第7天逐步增高。

2.细胞碱性磷酸酶活性测定:将收集的细胞反复冻融两次后,测定三组的不同时段的碱性磷酸酶活性,随着时问的增加其每组的AIP活性均有所增加,统计学分析第3天与第5天之间无差异,其余各时问点都有差异(P(0.05)。而三组之问的MG63细

三、细胞在膜上粘附与增殖的电镜观察

1.细胞在e~PTFE膜上粘附及增殖情况:膜上接种MG63成骨样细胞第一天(图4A),电镜观察到细胞零星的分散在膜上,细胞呈长梭形,伪足伸展长短不一,胞核清楚,胞浆丰富。膜上接种MG63成骨样细胞第五天(图4B),电镜观察到细胞呈片状分布在膜上不同的区域,多个细胞相互交联,细胞生长良好,细胞伪足伸展不充分,未见细胞伸人到空隙中。

2.细胞在nHⅣPA66膜上黏附及增殖情况:膜上接种MG63成骨样细胞第一天(图5A),电镜观察到细胞粘附在孔隙的边缘,孔隙的中间,形态有长梭形,伪足伸展良好,细胞形态多样,细胞伸出的伪足粘附在孔隙的表面,孔隙中接种MG63成骨样细胞第五天(图5B),电镜观察到细胞已经长在膜表面,呈片层状,细胞有长条形,梭形,形态各异。可观察到细胞有的两端跨越孔隙,有的粘附在孔隙的边缘,细胞生长良好,细胞相互交通。引导骨再生(GBR)技术在口腔医学领域,尤其是少量骨缺损的理想修复中发挥重要的作用。国内外许多学者通过动物实验及临床试验证实,膜材料能不同程度地增强骨组织再生能力,加快骨组织新陈代谢,有效的避免骨缺损的纤维愈合,促进骨性愈合。引导膜在GBR技术中发挥着关键的作用.该膜既要允许营养通过,又必须能隔离周围结缔组织细胞长人,同时具有良好的生物相容性,保证其留置体内期间不发生排斥反应口。随着GBR技术在口腔种植及骨缺损修复领域的应用越来越广泛,其研究也成为近年来的热、c GBR膜种类很多,按其在体内是否能降解主要分为可吸收膜和非可吸收膜两大类。可吸收膜日前存在着降解速度快,时间难以控制等问题,而不可吸收膜则需二次手术取出,增加了患者的复诊次数及手术痛苦。国外这两类膜都有成品出售,但价格昂贵,许多患者难以接受。为此国内许多学者致力于研究可作GBR应用的国产膜材料。c-PTFE膜是聚四氟乙烯树脂经热拉伸工艺处理后制成的医用高分子材料,生物相容性好,理化性能稳定,消毒使用方便。该材料已经广泛应用于骨折,肌腱断裂,血管,脏器穿孔的修补,其在整形外科的应用已有近30年的历史㈣。在口腔领域中,e~PTFE膜主要用于牙周病治疗和牙种植时引导骨再生。用于牙种植成品的←PTFE膜已有Gorc~Tex和Impra等H,由于生产工艺和设备属专利保护,产品价格十分昂贵。c-PTFE膜具有非常好的生物相容性,但是由于其为惰性膜材料,在用于GBR时需要二次手术取出,增加了患者的痛苦。nHA/PA66复合物是国内学者李玉宝等以新工艺将具有骨传导特性的纳米羟基磷灰石(nHA)与有机质高分子聚己二酰己二胺(PA66)进行共溶而制成的高分子聚合物(nHⅣPA66),是“十五”国家科技攻关计划研制出的具有我国自主知识产权和国际领先水平的新型纳米晶骨修复替代材料阝9国。该材料采用“常压共溶法”制各成生物膜,其结构一面疏松多孔,一面致密有少量微孔结构。其致密的一面能有效的阻止其他组织的长人,而疏松多孔的一面则利于骨组织的长入。在骨组织工程领域中,理想的支架材料应具有较高的孔隙率和孔隙贯通率,以及适于骨组织生长的力学支撑。nHⅣPA66膜其材料本身已作为骨替代材料用于临床,虽然不能完全降解,但可以长期保留于体内,所以不需要二次手术的取出,同时其双层结构的设计以期能发挥双重作用,即屏障作用和骨诱导作用。本实验观察结果显示,nHA/PA66膜对成骨样MG63细胞的生长没有抑制作用,M"值和ALP活性与对照组及空白组均无统计学差异。而扫描电镜观察,MG63细胞在nHA/PA66膜的粘附与增殖较卜PTFE膜更佳,进一步说明成骨样细胞在nHA/PA66膜的疏松面可以充分的生长,该膜具各良好的生物相容性。膜材料的结构和生物相容性是判定其能否作为GBR膜的主要因素。

本实验通过观察nHA/PA∞膜的结构及MG63成骨样细胞在其上的生长情况,对其作为GBR膜的可行性进行基础性研究和探讨。经过统计学分析和形态学观察充分说明nHⅣPA弱膜对MG63成骨样细胞的生长无抑制作用,MG63成骨样细胞在其组织面上粘附效果好,能够充分生长和增殖。

综上所述nHⅣPA66膜的结构和生物学特性均能符合GBR膜的要求,具有作为GBR膜的可行性。当然nHA/PA66膜是否能成为优良的GBR膜,还需进一步深入研究。