干扰串珠素表达对硬膜外瘢痕细胞中Ⅰ型胶原蛋白生成的影响

后正中入路单侧或双侧椎板切除术已成为腰椎手术的经典术式。术后硬膜外粘连是导致术后症状复发的重要原因之一。尽管再次手术胄邕松解粘连禾口切除瘢痕,但是术后3~6个月内粘连会重新产生,最终大多数患者的症状还是未得到改,甚至会产生更多瘢痕,从而增加医源性神经根损伤和硬膜撕裂的危险。硬膜外瘢痕形成历经3个阶段:第1阶段为局部炎性反应阶段,主要包括出血的停止、血块的凝固和各种趋化因子的释放;第2阶段为肉芽组织产生阶段,主要为成纤维细胞、巨噬细胞和内皮细胞大量增殖,胶原在细胞间质大量沉积,加之新生毛细血管网形成,创面以大量肉芽组织代之;第3阶段为瘢痕形成及组织重建,主要的组织修复细胞——成纤维细胞增殖,产生胶原纤维;随着胶原纤维的增多及成熟成纤维细胞转化为静止的纤维细胞,肉芽组织逐渐转化为瘢痕组织[2]。I型胶原蛋白是瘢痕的主要构成成分[3.4]。串珠素的硫酸软骨素链已被证明能够结合胶原蛋白,加速纤维的形成。

本实验从蛋白及分子水平观察干扰体外培养的大鼠硬膜外瘢痕成纤维细胞中串珠素的表达对I型胶原蛋白合成和分泌的影响,探讨通过抑制串珠素表达来抑制硬膜外瘢痕形成的可行性。

材料与方法

一、实验动物、试剂与仪器

1.实验动物:健康雄性SD大鼠,30只,体质量约为250g,2个月龄,购于山东鲁抗医药股份有限公司质检中心。

2.实验试剂:磷酸盐缓冲液(PBs)、乙二胺四乙酸定影液(英国),胎牛血清、16培养基(美国),慢病毒小发夹(RNA)(上海吉玛制药技术有限公司),聚合酶链反应(PCR)引物(上海生工生物工程有限公司),胶原蛋白兔抗大鼠坨G多克隆抗体一抗(Abcam公司,英国),I型胶原蛋白及内参辣根过氧化物酶标记的羊抗兔吒G二抗(北京博奥森生物技术有限公司),RNA提取试剂(Thzd试剂)、5倍浓度加载缓冲液(大连宝生物工程有限公司),体积百分比为75%的乙醇、氢氧化钠(由青岛大学医学院附属医院中心实验室提供),琼脂糖粉(Amresc。公司,美国),逆转录-PCR(RT-PCR)试剂盒(美国),DNA标识(相对分子质量为100OO0~700OO0)、可视性蛋白标识、AB超敏发光液(北京中山金桥生物技术有限公司),体积百分比为30%的丙烯酰胺、细胞组织快速裂解液(RIPA)、丽春红染色液(碧云天生物技术公司),甘氨酸、十二烷基硫酸钠(美国),5×Buffer缓冲液(上海索莱宝生物科技有限公司),甲醇(青岛福林化工有限公司),脱脂奶(伊利乳业有限公司)。

3.实验仪器:超净工作台(济南净化设各厂),离心机(Sigma公司,美国),电热恒温水浴箱(上海医疗器械七厂),各型号移液器(法国),二氧化碳细胞培养箱(德国),震荡仪(美国),全自动高压灭菌器(美国),低温离心机(美国),高速冷冻离心机BiofttgcPrimo(德国),超纯水设各(美国),恒温磁力搅拌器(中国金坛市科技仪器有限公司),精密电子天平(FA21上海天平仪器厂),精密pH值计(上海精密科学仪器有限公司),倒置荧光显微镜(Loca公司,德国),倒置相差显微镜(№kon公司,日本),冰点渗透压计(天津斯格瑞科技有限公司),实验用玻璃仪器(由青岛大学医学院附属医院中心实验室提供)。

二、实验方法

1.动物模型建立:30只SD雄性大鼠,采用体积百分比为10%的水合氯醛进行腹腔注射麻醉(04 mL/1OOg)。大鼠取俯卧位,取背部正中纵形切口,以L4或L5为中心,显露L4及L5全椎板,咬除棘突及全椎板,制作大小约12.5px×25px的缺损并取出缺损部位黄韧带,显露硬膜囊,彻底止血后用生理盐水冲洗创面3次,清除碎骨后逐层缝合切口。术后给予青霉素8万U肌肉注射。术后大鼠在同一条件下分组饲养。

2.成纤维细胞的培养及实验分组:大鼠术后第⒛天再次手术,沿原手术人路进人,取L45硬膜后方瘢痕组织,约5px×2.5px×15px大小,放入盛有1640培养基的培养皿中。用含青霉素钠/庆大霉素双抗液的PBS冲洗数次后,在超净台将瘢痕组织剪切至1mm2大小的碎块,再次用含青霉素钠/庆大霉素双抗液的PBS冲洗数次后用吸管吸净PBS,将组织碎块移人培养瓶中,每个组织碎块间距约为12.5px,放人37℃饱和湿度为5%二氧化碳的细胞培养箱中干燥3~4h,将含体积百分比为10%胎牛血清的1640培养基加入培养瓶中,以刚铺满培养瓶底为佳并标记为原代(P0),切忌加液及移动的过程中震荡、晃动培养瓶,使组织块漂浮而导致贴壁失败。加液后放置二氧化碳细胞培养箱内静置叨h后再次加人10%胎牛血清的16硐培养基约4mL。以后每隔2~3d换一次液,并每天观察组织块周围细胞爬出情况和形态特征。待细胞接近融合时轻轻震荡培养瓶使组织块飘起,个别组织块贴壁较牢,可用探针挑起,将组织块及培养液吸出。加入质量百分比为的胰酶消化,按1.2比例传代,以1×106个/mL细胞密度接种于培养瓶中。取第3代细胞常规消化,调整细胞密度,铺%孔板,每孔细胞数为0.5×104个,加入含体积百分比为10%的小牛血清100uL/孔,放人二氧化碳细胞培养箱过夜。2h后吸出培养液,用小牛血清稀释慢病毒分别至10:/mL、107/mL、I06/mL、105/mL,每组两孔分别加人稀释病毒100uL,放人二氧化碳细胞培养箱静置48~72h,然后在倒置荧光显微镜下观察,确定最佳感染复数(multiplicity clf inkcticln,MOI)值。取生长状态良好的细胞,用为的胰酶消化,铺孔板,每孔细胞数为0.5×105个,加人10%的小牛血清500uL放人二氧化碳细胞培养箱过夜。2h后吸出培养液,将细胞分为3组:慢病毒介导slaRNA干扰组、纯慢病毒无曲RNA组和空白组。慢病毒介导曲RNA干扰组加入用10%小牛血清调整最佳MOI值的慢病毒介导曲RNA500uL,纯慢病毒无slRNA组加入用10%小牛血清调整最佳MOI值的纯慢病毒无曲RNA液500uL,空白组加人10%的小牛血清500uL。然后放人二氧化碳细胞培养箱继续培养72h。

3.RT-PCR检测I型胶原蛋白mRNA的表达:以Trizd法提取细胞`总RNA,用紫外分光度计测`总RNA的纯度和浓度,用质量百分比为1%的琼脂糖凝胶电泳鉴定其完整性。取总RNA1ug反转录为cDNA,样品于-⒛℃保存。PCR引物由上海生工生物工程有限公司设计。引物序列:I型胶原蛋白:上游5’习CC AAAGGAGAGAGCGGTAA-3’,下游5’-GACCAGGGA GACCAAACTCA-3,爿△殳卡u蔓为693bp;β-atitin:⊥J许5’-CGTCTTCACCACCATGGAGA-3’,ˉ下济宇5’-CGG CCATCGCCACAGTtT¨3’,片段长度为300bp。PCR反应条件:I型胶原蛋白:%℃预变性5血n,%℃45 s,ω℃30s,72℃1血n,共33个循环;最后72℃延伸10血n,4℃终止反应。以质量百分比为2%的琼脂糖凝胶,在0,5×TBE缓冲液中电泳进行PCR产物鉴定,在凝胶自动成像系统中对条带进行扫描,分析图像灰度。

4.Wccrn Blot检测I型胶原蛋白的表达:取第3代细胞,调整细胞密度为5×106个/mL,接种于75培养瓶。分组加液,9ZI h后提取总蛋白。Weem Bl忒检测I型胶原蛋白的表达。具体步骤:①提取蛋白(本阶段所有步骤均在冰上操作):培养⒛h后,用RIPA裂解液裂解细胞(4OO uL Pt1PA+4uL苯甲基磺酰氟)提取细胞总蛋白。②取50ug蛋白上样行质量百分比为⒓%的聚丙烯酰胺凝胶电泳、转膜、封闭。③PBS抗体稀释液洗涤聚偏氟乙烯膜3次(15min/次)后稀释一抗:兔抗大鼠胶原蛋白多克隆抗体⒈500滴加一抗聚偏氟乙烯膜上,室温在摇摆床上孵育2h或4℃过夜,如过夜孵育,次日PBS抗体稀释液洗膜3次(15mh/次)。④滴加辣根过氧化物酶标记的胶原蛋白及内参辣根过氧化物酶标记的羊抗兔坨G二抗(1∶5OOo)在聚偏氟乙烯膜上,室温孵育120血n,抗体稀释液洗膜3次(15min/次)。⑤滴加约0.2mL AB发光液,至荧光条带出现,曝光、显影、定影。⑥Qualltity one软件进行灰度分析G

三、统计学处理应用叩SS15,0统计学软件和JMTJFⅩ14.0简易统汁软件,计量资料用厉±s表示,3组间比较采用单因素方差分析,若差异有统计学意义,则再采用SNK叼检验进行组间两两比较,P<0。O~o^认为差异有统计学意义。

结果

—、动物模型情况术后动物生理情况较好,无下肢瘫痪、情绪波动、感染及死亡。术后⒛d二次手术时可见硬膜外瘢痕大小约5px×2.5px×15px,瘢痕与硬膜囊粘连较紧密,钝性分离后硬膜囊大多可保持完整。

二、HE染色观察瘢痕的变化过程术后1周可见组织间隙增宽、水肿,大量炎性细胞浸润。术后2~3周瘢痕组织中细胞增殖、分化明显,成纤维细胞活性高、形态好。术后4周胶原沉积,毛细血管生成,肉芽组织大董生成。术后5、6周瘢痕中成纤维细胞减少,肌成纤维细胞增多大量胶原沉积,肉芽组织转化为致密的瘢痕组织(图1,2)。

三、MOI值的检测结果MOI值为10OO时细胞出现裂解和凋亡(图3a),MOI值为10、1时转染效果较差,荧光镜下观察到较少荧光染色(图3b)。MOI值为100时细胞形态正常,轮廓清晰(图3c),从而确定其为最佳MOI值。

四、RT-PCR检测I型胶原蛋白mRNA的表达变化RT-PCR测定慢病毒介导曲RNA干扰组、纯慢病毒无sh1廴NA组、空白组I型胶原蛋白RNA目的条带吸光度与内参条带吸光度比值平均分别为0.⒄3±0.003、0.473±0.01、0.475±0013,差异有统计学意义(F=2.517,P=0。OO0,图4),慢病毒介导bllRNA干扰组I型胶原蛋白表达量较纯慢病毒无血RNA组和空白组明显减少,差异均有统计学意义(P<0.05)。

五、Weern Bl⒍检测I型胶原蛋白mRNA的表达变化1测定慢病毒介导sllRNA干扰组、纯慢病毒无曲RNA组、空白组I型胶原蛋白RNA目的条带吸光度与内参条带吸光度比值平均分别为0190±0.0OD^、2,116±0,012、21,差异有统计学意义(F=2,939,P=0,OO0,图5),慢病毒介导shRNA干扰组I型胶原蛋白表达量较纯病毒无曲RNA组和空白组明显减少,差异均有统计学意义(P<0.05)。

讨论

有研究已经证实瘢痕组织中胶原蛋白的合成是正常组织的3倍。而胶原蛋白的数量、组成比例与瘢痕组织的成熟、塑形及挛缩等过程密切相关。硬膜外瘢痕叉叫硬膜外纤维化,是指在硬膜外腔的手术涉及范围内形成的瘢痕组织或纤维化,是机体对创伤的修复反应。瘢痕的粘连和收缩会牵拉硬膜和神经根,限制其活动,被瘢痕包绕的神经根受到非正常的牵拉和挤压,神经纤维的轴浆运输、动脉血供及静脉回流受阻,神经根和背侧神经节对机械压迫很敏感,会产生一系列症状,如疼痛、麻木及下肢肌力降低等”

近年来,对硬膜外瘢痕防治的研究大多是椎板切除术后如何通过物理或化学屏障来减少因瘢痕粘连导致的并发症阢叫。但关于通过瘢痕形成过程中抑制其主要构成成分的生成来减轻椎板切除术后硬膜外瘢痕形成的相关研究还较少.目前已有学者[12]在人体进行“无瘢痕愈合”的相关研究,认为胎儿期所发生的无瘢痕愈合所处的外环境不是其受创后无瘢痕愈合的关键因素,组织固有的内在环境较外部环境更重要。有研究[:]认为成纤维细胞可能是无瘢痕愈合最主要的效应细胞,成纤维细胞作为创伤后修复的主要功能细胞,可迁人床上局部进行增殖、分化及合成胶原蛋白等,在创伤后的愈合过程中,成纤维细胞和胶原纤维过度增生形成瘢痕并导致局部粘连。

胶原主要由成纤维细胞合成和分泌,而有些学者研究发现胚胎时期无瘢痕愈合过程中并不缺乏胶原沉积,这与胶原的比例和有序排列有关,Ⅲ型与I型胶原的比例决定了胶原纤维的粗细。胚胎皮肤I、Ⅲ型胶原的比例和排列规律与成人不同,与成年皮肤相比,胎儿皮肤创伤愈合中胶原合成和分泌速度较快,尤其是合成Ⅲ型胶原较多。与I型胶原相比,Ⅲ型胶原更易被特异或非特异的胶原酶所降解,代谢较快,最终胶原沉积较少、排列规则,使胎儿皮肤中Ⅲ型与I型胶原的比例高于成人,冈而胶原较细、排列较规则,从而表现出无瘢痕愈合的特征田。伴随胎儿成长和成熟,Ⅲ型与I型胶原的比例逐渐接近成人,创面愈合也由无瘢痕愈合转为瘢痕愈合。胚胎的成纤维细胞生成胶原的能力也较成体成纤维细胞强,这也是无瘢痕愈合的可能原因之一[16]。本研究结果显示通过慢病毒介导的曲RNA干扰成纤维细胞中的串珠素后,其生成的I型胶原蛋白量较纯慢病毒无shRNA组和空白组明显减少,差异均有统计学意义(P<0.05),这说明通过抑制瘢痕成纤维细胞的串珠素表达能够有效减少I型胶原蛋白的生成。这种方法无论是从I型胶原蛋白是瘢痕主要构成成分方面来讲,还是从I型胶原蛋白在瘢痕生成过程中分泌胶原所占比例增多而导致机体由胎儿期的无瘢痕愈合转化为成体瘢痕愈合方面来讲,理论上都能够做到有效地抑制或减少硬膜外瘢痕的形成。本实验证实了串珠素对瘢痕中重要的组成成分I型胶原蛋白的生成有重要影响,为我们从减少瘢痕主要组成成分来控制术后硬膜外瘢痕的形成以及通过调整术后硬膜外瘢痕中Ⅲ型与I型胶原的比例来达到无瘢痕愈合的目的提供了一定的理论支持。

综上所述,通过干扰硬膜外成纤维细胞串珠素表达而达到抑制硬膜外瘢痕的形成是可行的。由于本实验研究在体外进行,囚此对于在更加复杂的体内环境中是否可获得理想结果尚不能确定,还有待于进一步进行体内试验。

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