脑苷肌肽改善阿尔兹海默氏病小鼠病情的机理分析

引言

阿尔兹海默氏病(Alzhomers disease,AD)是一种常见的老年期神经退行性疾病,俗称老性痴呆;其致病机理尚未明确,缺乏有效治疗的方法。AD临床表现为病人在意识清醒的状态下智能全面减退,包括记忆力、注意力、计算力、判断力、抽象思维能力、语言功能等减退,同时出现情感和行为障碍,最终丧失独立生活和工作能力[1.2]。脑苷肌肽(Cattle Encephalon CJlyc。side and Ignotin Iection,cEGI)是目前临床治疗AD疗效较好的一种药物[3],主要成分为多肽与多种神经节苷脂。为了解析脑苷肌肽对AD病理的作用机制,本研究通过制作阿尔兹海默氏病小鼠作为模型,检测氧化应激水平和免疫学指标,并观察行为学指标,分析脑苷肌肽对AD小鼠的作用机制,为AD治疗奠定理论基础。

1材料与方法

1.1实验动物8月龄昆明雄鼠(成都医学院实验动物中心提供,体质量为(22±4)g,行为学实验每组12只,其它动物实验组每组6只。

1.2试剂脑苷肌肽购于诺氏制药(吉林)有限公司。脑苷肌肽为无色或微黄色澄清液,主要成分为多肽和多种神经节苷脂,每1mL含多肽3,2mg,神经节苷脂50ug。

1.3模型的建立D半乳糖120mg/kg和亚硝酸钠90mg/kg腹腔注射8月龄小鼠,1次/d,持续60d。为增强老年痴呆(AD)疾病模型效果,于小鼠9月龄时,在左侧侧脑室一次性注射2uL聚集态的Aβ535。正常10月龄雄性小鼠作为正常老年组对照(CON)。AD小鼠于9.5个月开始注射脑苷肌肽(0,4mg/kg,i,m,按多肽计),1次/d,持续14d。

1.4氧化应激水平检测参照文献E5],处死小鼠迅速取出3组小鼠的脑组织,每组6只,分离其海马区大脑皮层,匀浆后利用LC/MS/MS检测其中的8异构前列腺素(8-Isoprostanc)含量。

1.5 ELIsA检测炎症细胞因子取小鼠大脑组织,匀浆后使用ELISA试剂盒(Mi11ipore公司)检测TNFα,IL-1β和IL6含量,在450nm处读取波长,比照标准品计算其浓度。

1.6硫磺素s染色取小鼠大脑组织,包埋于OTC中,迅速置于干冰冷冻。大脑切片为冠状切片,切片位置为整个含大脑皮层在内的海马区部分,切片厚度14um,切片后进行硫磺素S染色(Sigma公司)。其主要染色步骤为:10%福尔马林固定,二甲苯脱水;1×PBS(pH 7.4)冲洗;1%硫磺素S染色10min;1×PBS(pH 7.4)冲洗;70%乙醇洗脱10min;1×PBS(pH7.4)冲洗;封片剂封片;封片24h后利用绿色荧光(λ=495nm)激发光拍片;4℃保存。

1.7 Morris水迷宫实验测试3组小鼠模型制各以后,进行Morhs水迷宫实验进行学习记忆能力测试"。首先使小鼠熟悉测试的环境,次日开始正式训练。实验分为两部分:1,定位航行实验:每天上、下午各1次,每只小鼠每次训练120s,两次训练间隔30s,历时5d。训练时随机选择一个人水点,将其面向池壁放人水中。观察记录小鼠120s触到平台的时间(逃避潜伏期)。2,空间探索实验:在第6天下午撤除平台,小鼠于原平台对侧象限入水,观察其120s内在中心区停留时间百分比和通过原平台位置次数。

1.8数据分析使用SPSS13.0软件进行统计分析,以均数±标准差(Mean±SD)表示,组间比较采用单因素的方差分析(ANOVA)。统计分析使用Studerlt'st test,P<0.05为差异有统计学意义,P(0.01为差异有显著统计学意义。

2结果

2.1氧化应激水平检测8异构前列腺素是反映生物体内细胞、组织或器官中氧化应激状态的关键指标。含量检测分析(如图1)显示相对于CON组,AD组大鼠大脑皮层组织的泓异构前列腺素含量从8,73pg/mg升高至13,46pg/mg,表明在AD病情进展过程中,氧化应激水平升高。通过脑苷肌肽的治疗,AD+CEGI组小鼠大脑皮层组织的8异构前列腺素含量明显降低,其含量为9,72pg/mg;表明脑苷肌肽可以有效恢复部分因AD所导致的氧化应激水平的升高,但并不能完全恢复正常,其8异构前列腺素仍高于正常小鼠对照组。

2.2炎症细胞因子检测对照组、AD模型组与治疗组TNFα,IL1β和IL6表达水平情况如图2所示,AD模型组小鼠大脑皮层TNRα和IL-1β水平较对照组显著升高,相对比值分别为1.29和1.19;而IL6差异不显著为1,04。AD+CEGI组与AD模型组小鼠大脑皮层组织的TNpα含量明显降低,其相对比值为1.09;II'1β与IL6无显著变化,相对比值分别为1.16与1,06。结果表明脑苷肌肽可以有效恢复囚AD所致的TNα升高。

2.3硫磺素染色结果分析比较治疗组与AD模型组差异,硫磺素染色标记大脑皮层淀粉样斑块结果如图3,相对面积比较法统计分析,相对面积(%)=病理部位面积/切片大脑皮层总面积,结果如图4。由于实验小鼠的年龄偏大,正常小鼠组也会出现少量的淀粉样斑块,相对染色面积为0.44%;相对与正常小鼠而言AD小鼠淀粉样斑块明显增多,相对染色面积上升至1,48%;通过脑苷肌肽治疗后,AD+CEGI组小鼠大脑皮层的淀粉样斑块呈现减少趋势,相对染色面积为1.13%,但仍高于正常小鼠。

2.4 Morris水迷宫实验测试在定位航行实验中,与CON组比较,AD组其逃避潜伏期明显延长,表明其方向判断、学习记忆能力降低。通过脑苷肌肽的治疗,AD+CEGI组与AD组比较,其逃避潜伏期显著缩短,表明其学习记忆能力有所提高。空间搜索实验中,AD组较CON组中心区域停留时间百分比和通过原平台位置次数明显下降,表明其空间位置定位能力降低;脑苷肌肽的治疗后,AD+CEGI组与AD组比较,上述指标明显增加(表1)。

3讨论

氧化应激是自由基在体内产生的一种负面作用,被认为是导致衰老和疾病的一个重要因素。AD患者大脑常出现氧化应激的异常升高L7川。本研究发现,脑苷肌肽的注射治疗,能降低AD小鼠脑皮层组织的阱异构前列腺素含量,同时还可以降低AD所至氧化应激水平,表明脑苷肌肽在调节脑组织氧化应激水平中起到了一定的作用。炎症反应是AD病神经病变的重要指标。TNFα是炎症反应过程中最早出现与最重要的介质,能激活中性粒细胞与淋巴细胞,增强血管内皮细胞通透性,通过多种途径导致神经组织的损伤,在AD的发病中起着重要的作用。IL1β是常见的一种亚型,由活化的巨噬细胞所产生,刺激促进T细胞分泌'2,并促进B细胞的增殖产生抗体。IL6是炎性反应的促发剂,能诱导B细胞分化和产生抗体,并诱导T细胞活化增殖、分化,参与机体的免疫应答。本研究结果显示AD小鼠的TNpα和IL1β显著升高,而IL6差异不显著;通过脑苷肌肽的治疗后,其TNα含量明显降低,IL-1β差异不显著,表明炎症细胞囚子参与了AD小鼠组大脑皮层损伤过程,且脑苷肌肽治疗可明显降低TN,α,可能会缓解脑损伤。淀粉斑块一直被当作是阿尔兹海默病的分子生物标记物。淀粉样蛋白级联假说[1犭认为脑内淀粉蛋白前体(amyloid protein precursor,APP)非正常代谢使得阡淀粉样蛋白(βamyloid,Aβ)产量增多、降解减少,引起Aβ大量聚积形成淀粉斑块,产生神经毒性,触发AD。

本研究中正常组小鼠脑组织也出现了少量的淀粉斑,可能与年龄偏大有关;脑苷肌肽的治疗后,小鼠的淀粉斑呈现出明显的减少趋势,表明脑苷肌肽的治疗是有效的。Morhs水迷宫作为脑学习记忆机制研究的一种实验手段,其在AD研究中的应用非常普遍。我们采用Morhs水迷宫试验进一步验证脑苷肌肽的治疗效果。使用脑苷肌肽治疗后,AD小鼠逃避潜伏期显著缩短,表明其学习记忆能力有所提高;而空间搜索实验也为类似的结果。本研究以阿尔兹海默氏病小鼠为模型,通过脑苷肌肽治疗来评估其疗效,结果表明脑苷肌肽可以有效缓解AD小鼠病情,改善其神经功能,提高其记忆学习能力,可能是一种治疗AD的潜在药物,为临床使用脑青肌肽治疗包括AD在内的神经退行性疾病奠定理论基础。

参考文献

[1]王婷,李洪鹏,于爱娇.TGF-β对阿尔兹海默氏病作用的相关研究进展[J].解剖科学进展,2011,(06):597-601.

[2]Selkoe DJ.Alzheimer's disease:genes,proteins,and therapy[J].Physiological Reviews,2001,(02):741-766.

[3]刘晓娟,李艳荣.脑苷肌肽对老年性痴呆的疗效观察[J].包头医学院学报,2007,(01):43-44.

[4]张滢,陈杏丽,金卫东.脑苷肽治疗中晚期血管性痴呆16例[J].医药导报,2007,(07):779-780.

[5]Bastani NE,Gundersen TE,Blomhoff R.Determination of 8-epi PGF(2alpha)concentrations as a biomarker of oxidative stress using triple-stage liquid chromatography/tandem mass spectrometry[J].Rapid Communications in Mass Spectrometry,2009,(18):2885-2890.doi:10.1002/rcm.4197.

[6]Brandeis R,Brandys Y,Yehuda S.The use of the Morris Water Maze in the study of memory and learning[J].International Journal of Neuroscience,1989,(1-2):29-69.

[7]Aiscn PS.The inflammatory hypothesis of Alzheimer disease:dead or alive[J].Alzheimer Dis Asssoc Disord,2008,(01):4-5.

[8]陈平,梁立平,杨杰.线粒体氧化应激及其在神经退行性疾病神经细胞凋亡中的作用[J].第三军医大学学报,2006,(16):1726-1728.

[9]Wyss-Coray T.Inflammation in Alzheimer disease:driving force,bystander or beneficial response[J].Nature Medicine,2006,(09):1005-1015.

[10]Griffin WS,Mrak RE.Interleukin-1 in the genesis and progression of and risk for development of neuronal degeneration in Alzheimer's disease[J].Journal of Leukocyte Biology,2002,(02):233-238.