胱抑素C的IgG-和IgY-ELISA检测体系的建立与评价

胱抑素C(Cystaun C)是一种半胱氨酸蛋白酶抑制剂,广泛存在于各种有核细胞和体液(玫叫囟脊液、唾液、尿液、精液等)中,分子量为13.3kDa。Cystaon C能够自由通过肾小球,并且由肾小管重吸收后降解,正常生理情况下几乎没有影响其稳定的因素[l]。因其具有产生速率恒定、只能通过肾小球滤过排泄、且在肾小管内可以完全被重吸收降解等特点,使血清Cystatin C已经成为反映肾小球滤过率(GFR)变化的内源性标志物之一,在反映肾功能早期损害等方面是一个可靠的临床诊断指标,正被广泛应用于糖尿病、高血压、冠心病、肾移植等疾病的肾功能监测[6]。目前,用于检测Cystatin C的多抗主要有兔IgG和鸡IgY。那么,基于这两种多抗的双抗夹心EL⒙A法,是以IgG还是以IgY为捕获抗体,能够获得更高的检测敏感度和特异性呢?本研究建立了三种基于IgG和IgY的双抗夹心ELISA检测体系,通过对三种EI'ISA体系进行比较,寻找提高血清Cystatin C检测灵敏度和特异性的方法,为Cystatin C临床检测提供可靠依据。

1材料与方法

1.1材料25w龄产蛋罗曼母鸡和新西兰兔,常规饲养;Cystatin C购于Diazyme公司(SDZ9011001NI');辣根过氧化酶标记的兔F(ab')2抗鸡IgY购于Rocklal△d公司(3034304);辣根过氧化酶标记的羊抗鸡IgY和辣根过氧化酶标记的羊抗兔IgG购于Santa Cruz公司(s⒍2901,sc—⒛54);完全福氏佐剂和不完全福氏佐剂购于Sigma公司(,5881,R 5506);Lowry蛋白分析试剂盒购于Pierce公司(23240);蛋白质分子量标准购于Takara公司(D532S);Sepharose4B Fast Flow(预装Pr。tein A)购于GE公司(17040301);HRP显色液ECI'购于Milliporc公司(WBKL∞100)。

1.2鸡IgY的制备、纯化及鉴定完全弗氏佐剂乳化人源Cysta0nC(250ug/mL),皮下多点免疫罗曼母鸡,2w加强免疫1次(不完全弗氏佐剂乳化抗原);收集免疫后的鸡蛋,采用水稀释-盐析法提取IgY抗体[冂;采用Lowry法测定浓度,SD⒊PAGE检测纯度,间接ELISA法测定效价。

1.3兔IgG的制备、纯化及鉴定完全弗氏佐剂乳化Cystatin C(250ug/mI'),皮下多点免疫新西兰兔,2w加强免疫1次(不完全弗氏佐剂乳化抗原);收集免疫后的兔血清,采用琼脂糖凝胶4B IgG快速纯化系统(Sepharose4B Fast Flow,预装Pr。tein A)纯化IgG抗体;采用Lowγ法测定浓度,SD⒏PAGE检测纯度,间接ELISA法测定效价。

1.4双抗夹心IgG-和IgY-ELIsA体系的建立用碳酸盐缓冲液(pH9,⑴稀释捕捉抗体后包被酶联板,4℃过夜;洗涤后封闭,加人待检样品Cystatin C和阴、阳性对照,以PBS缓冲液为空白对照,样品中加人10uL正常人血清模拟临床检测,37℃孵育,洗涤;依次加人检测抗体及酶标抗体,37℃孵育,洗涤;加人TMB底物,37℃孵育30min后加人2mmol/I'硫酸终止反应;酶标仪检测A492的OD值。以(OD样品-OD阴性)/OD阴性>2.1倍为阳性界定标准。三种检测体系分别为:I:捕捉抗体IgG+检测抗体IgY+抗鸡IgY酶标抗体;Ⅱ:捕捉抗体IgG+检测抗体IgY+兔F(ab')2抗鸡酶标抗体;Ⅲ:捕捉抗体IgY+检测抗体IgG+抗兔IgG酶标抗体。

1.5灵敏度分析将2ug/mL的Cystatin C用PBS缓冲液按1:5(v:v)进行倍比稀释,采用上述三种ELISA体系分别检测,绘制标准曲线并确定Cystatin C最低检测浓度。

2结果

2,1抗体纯度及滴度确定抗Cystatin C兔IgG与鸡IgY的蛋白浓度测定后,经SD⒊PAGE及凝胶成像系统分析其纯度分别为95%和92%(图1)。抗体倍比稀释并用间接EIISA法测定效价,以(OD样品-OD阴性)/OD阴性>2.1倍时的最大稀释度为待测IgY的抗体效价,确定纯化后的IgG与IgY的滴度分别为31.25 ng/mL和15.63ng/mL(表1)。

2.2夹心法最隹反应条件的确定,棋盘滴定法确定双抗夹心EusA最佳反应条件,捕捉抗体的最佳包板浓度为10uymL,样品孵育时间为1h,检测抗体的最佳浓度为1ug/mI'。

2.3 ELIsA法的灵敏度分析采用三种双抗夹心ELISA法检测1:5(v:v)倍比稀释的含正常人血清的Cystaon C(图2A),以只加正常人血清的孔为阴性对照,每组样品为三复孔;并以(OD样品一OD阴性)/OD阴性值绘制检测曲线,以样品测定值)阴性值2.1倍为阳性界定标准,确定Cystatln C的最低检测浓度(图2D。结果显示,体系I可检测最低检测浓度为7.51·g/m(阴性对照OD值为0,737)的Cyst乩nC,体系Ⅱ可检测最低检测浓度为13ng/mL的Cystatin C(阴性对照OD值为0。313);体系Ⅲ可检测最低检测浓度为10ng/mL的Cystatin C(阴性对照OD值为0,31)。

3讨论

临床上,Cystaon C可以作为判断肾小球滤过率的分子标志。由于血清中Cystatin C的浓度较低,故其测定方法需较高的分析灵敏度和特异性,以及更好的线型度、更宽的检测范围,而且还要避免ELISA反应信号放大带来假阳性。目前,我国还没有研发基于IgY的ELISA检测试剂盒用于Cystaun C检测,而将IgY应用于免疫诊断中,可减少假阳性的出现,从而提高检测的特异。IgY是近年来发展应用的一种新型抗体,和哺乳动物lgG相比,有以下优点:(1)不与哺乳动物的IgG发生交叉反应;(2)保存方便,在常温下可以储存3个月左右,在4℃可以保存6~12个月抗体活性不下降;(3)抗体的获得量大,一只鸡蛋大约含20~100mg的抗体;(4)不激活哺乳动物(特别是人)的Fc受体L"叫。我们的研究结果显示,以IgG为捕捉抗体且酶标抗体是抗鸡IgY时(体系I),oD值均高于其它检测体系约2,0倍,且阴性对照OD值为0.737,可见该体系极易产生非特异吸附,并由此造成灵敏度高于正常的假阳性结果;而以IgY为捕捉抗体(体系Ⅲ)或IgG为捕捉抗体且检测酶标抗体是兔F(ab)2抗鸡时(体系Ⅱ),其oD阴性对照值为0.3左右。由此可见,捕捉抗体造成的非特异性吸附是由抗体的Fc段产生,体系Ⅱ以是兔F(ab')2抗鸡为酶标抗体降低了这种非特异吸附;而IgY因其不与Fc结合的特性(体系Ⅲ),使其非特异性吸附降低。可见在固相免疫测定法中,包被的捕获抗体与结果特异性直接相关。我们建立的双抗夹心法中,在样品中加人含正常人血清来模拟临床检测,检测结果显示,以IgY为捕捉抗体(体系Ⅲ)和IgG为捕捉抗体且酶标抗体是兔F(ab')2抗鸡时(体系Ⅱ),检测体系用于测定Cystatin C的特异性及灵敏度较好,说明这两种检测法可用于临床检测以及研究Cyst菠in C的其他生物学作用。

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