氯胺酮多次给药对大鼠肝微粒体内细胞色素P450_2B酶的诱导作用

细胞色素P450(CYP450)是人体内重要的混合功能氧化酶,由CYP4501A、2B、2C、2D、2E、3A等亚型酶组成,能参与众多内源性和外源性物质的I相代谢反应[1]。氯胺酮既是临床常用麻醉药品,也是一种新型毒品,长期使用会给人体造成负面影口向[2]。有研究表明氯胺酮在体内主要经由CYP4502B(CYP2B)酶代谢[矧,笔者认为长时间使用氯胺酮会对CYP2B酶有影响,能够引起基于同一代谢酶的药物相互作用,故有必要研究氯胺酮多次给药后对CYP2B酶活性的影响。为进一步深入了解氯胺酮的体内过程以及临床合理用药提供科学研究资料。

1材料与方法

1.1材料

德国Thermo低温高速离心机;德国Thcrmo低温冰箱;岛津UV2450型紫外分光光度计;日立,4500型荧光分光光度计。氯胺酮注射液购自福建古田药业有限公司;试卤灵、7戊氧基试卤灵购自Fluka公司;还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)购自Los Ange1es公司;考马斯亮蓝G250购自上海源聚生物科技有限公司;二硫苏糖醇购自Merck公司;其它试剂均为分析纯。健康成年SD大鼠16只(忿,体质量220~250g)购自四川大学华西实验动物中心,合格证号:SYXK(2008-113。实验前适应性喂养1w。

1.2溶液配制试卤灵系列标准溶液:试卤灵对照品适量,用二甲基亚砜溶解稀释,分别配制成100、50、20、10、5umol·Ll的系列标准溶液。Tris缓冲液的配制:取适量,加水配成浓度为的溶液,用盐酸调pH为7,4,备用。蔗糖溶液的配制:称取蔗糖、磷酸氢二钾和EDTA适量,加水,配成浓度分别为蔗糖0,25mo1·L、磷酸氢二钾10mmol·L-ÈDTA为1mm。l的溶液,用6mol·L1盐酸调pH为7.4,各用。焦磷酸钾溶液的配制:称取适量的焦磷酸钾、EDTA,加水配成浓度分别为焦磷酸钾0.1m。l·Ll、EDTA为1mmol·L1的溶液,用盐酸调pH为7.4,备用。Tris HCL缓冲液的配制:称取适量的Tos、EDTA、二硫苏糖醇,量取适量的甘油,加水配成浓度分别为Tris为0.1mol、EDTA为0,1mmol·L1、二硫苏糖醇为0,1mmol·L-、甘油为20%的溶液,用盐酸调pH为7.4,各用。

1.3动物实验与肝微粒体的制备健康成年SD大鼠,忿,随机分为实验组和对照组,每组8只。实验组大鼠按10mg·kg l·d1氯胺酮生理盐水溶液灌胃给药,连续10d。对照组大鼠按同等剂量生理盐水灌胃给药,连续10d。在第11天,处死大鼠,将肝组织按1:3与蔗糖溶液混合匀浆,匀浆液以19000g离心20min,弃去沉淀,取上清液,按每1mL上清液加入0.1mL氯化钙(88mmol·L1),放置5min。再于4℃下以27000g离心15min,弃去上清液,沉淀经焦磷酸钾溶液轻轻洗涤后,用Tris HCl溶液吹打分散后,所得浅粉色溶液即为肝微粒体E5]。以考马斯亮蓝为显色剂,利用UV Vis法,于595nm测定吸光度,计算肝微粒体蛋白浓度[6]。

1.4 CYP450总含量的测定依据T,Omura和R.⒌to方法的原理[冂,利用CYP450能被CO还原,产物在450nm处有最大吸收,测定肝微粒体内CYP450总量。取制得的肝微粒体适量,加人适量的Tos缓冲液,使肝微粒体的蛋白终质量浓度大约为0,5mg·mL1,然后加人适量的保险粉摇匀溶解后立即在400500nm处进行基线扫描,扫描完后立即通人CO气体30s,再次扫描。记录在490nm和450nm的扫描数据。计算肝微粒体内CYP450总含量。

1.5 CYP2B酶活性的测定本实验利用⒎戊氧基试卤灵在CYP2B酶催化下,发生O-去烷基化反应,生成试卤灵,反应式如下。通过向待测肝微粒体系中加入7戊氧基试卤灵,孵育一段时间后测定体系中试卤灵的含量,考察CYP2B酶活性。

2结果

2.1氯胺酮对肝微粒内CYP450总含量的影响根据CYP450CO结合物的摩尔消光系数为91L·mmo11·cm-l,按Beer定律计算CYP450的含量。计算公式如下:CYP450(nmol/mg protein)=(A5。—A49。)×1000/(91×C)。其中,C为被测样品的蛋白质量浓度(mg·mL1)。按照上述方法测定后,给药组和对照组大鼠肝微粒中CYP450含量分别是(0,679±0,2160nmol·mg和(0.398±0.109)nmol·mg。结果经莎检验差异具有显著统计学意义,P<0.01。

2.2氯胺酮对肝微粒体内CYP2B酶活性的影响

2.2.1检测波长的选择取适量试卤灵,用二甲基亚砜配制成100umol·L1的溶液,取上述溶液10uL,加入到肝微粒溶液中,溶液终体积为2,0mL,肝微粒蛋白终质量浓度为0.1mg·mL分别于450~580nm扫描试卤灵激发波长(λcx),于550~650nm扫描发射波长。结果显示,试卤灵的λex为570nm,λem为580nm。选择上述波长为检测波长。

2.2.2试卤灵标准曲线的绘制取试卤灵系列标准溶液各10uI冫,加入到肝微粒溶液中,溶液终体积为2.O mL,肝微粒蛋白终质量浓度为0,1mg·mL-1。于λex570nm和λem580mm处测定荧光强度,以试卤灵浓度做为横坐标,以荧光强度做为纵坐标,绘制标准曲线图。结果显示,试卤灵在25~500nmol·I'1范围内,线性关系良好,标准曲线为l/=10.933X+21.219'=0.9999。

2.2.3孵育时间的优化取7戊氧基试卤灵1mg,用二甲基亚砜稀释至5mL。取上述7戊氧基试卤灵10uI',加人到肝微粒溶液中,于37℃加人NADPH溶液启动反应。反应体系终浓度为2.0mL,肝微粒蛋白终质量浓度为0.1mg·mI'1,NADPH终浓度为250umol·I。分别于5、10、15、20、30、45、60mim在检测波长处测定荧光强度,以时间做为横坐标,以荧光强度做为纵坐标,结果显示,产物随孵育时间延长而增加,在30min内呈线性增长(图1)。故选择30min作为肝微粒体CYP2B酶底物代谢的孵育时间。

2.2.4氯胺酮对CYP2B酶活性的影响按照建立的方法,于30min取出孵育样品,在λex570nm、λcm580nm处,测定荧光强度。以单位时间单位质量蛋白生成的试卤灵的量衡量CYP2B酶活性,单位为pmol·min l·mg1。结果显示:给药组和对照组的7戊氧基试卤灵的O-去烷基活性分别为(13.40±3.15)pmol·min1·mg1和(7.04±2,09)pmol·min1·mg l,经莎检验差异具有显著统计学意义,P<0.001。

3讨论

本实验分别考察了试卤灵和7戊氧基试卤灵激发光谱和发射光谱。结果表明:代谢产物试卤灵的λex为570nm,λcm为58O nm,底物7戊氧基试卤灵的λex为470nm,λem为540nm。由于试验以代谢产物生成速度表示CYP2B酶的活性,故选择试卤灵的波长做为检测波长。孵育时间的试验表明:前30min荧光强度随时间延长而增强,而30min后底物不再明显增强。这可能是酶活力在前30min保持良好,不断将底物转换为其代谢产物,而随着时间的延长,酶活力下降,代谢产物浓度趋于稳定。为了获得最大的测定灵敏度,笔者选择线性范围内的最大时间点30min作为孵育时间。CYP2B酶是CYP450超基因家族中重要的亚型酶,临床上有15%-20%的药物是CYP2B酶底物。本实验结果显示:氯胺酮多次给药后,能够增加CYP450总含量,并能显著诱导CYP2B酶的活性。这说明CYP2B酶底物与氯胺酮联合用药时,能够发生药物相互作用。尤其对于长期服用氯胺酮的滥用者来说,使用CYP2B酶底物的药物时,其在体内的代谢消除速率要明显高于正常人,故需在临床用药时对这类人群给予注意。

参考文献

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