益智防呆方对学习记忆障碍小鼠的行为学影响

轻度认知障碍[1]是介于自然老化和早期老年性痴呆之间的一种过度状态,主要表现为记忆障碍。美国国家衰老研究所(Nat0naHnstitute of Aging,NIA)和阿尔茨海默病学会(Alzhcims Association,AA)专家组制定的阿尔茨海默病(Alzheimers disease,AD)最新诊断标准将MC-I视为AD发病的一个早期阶段,强调早期干预MCI有助于AD的防治。本课题组前期研究发现:培元益智方治疗MCI,在改善记忆障碍方面取得可喜疗效[3]。此外,经MCI中医证素临床调查发现的常见病位为心、肾,心证以心气血虚为主,肾证以精亏、气虚为主,病理基础为血瘀、痰浊,与文献报道结论相符。本实验在MCI中医证素临床调查基础上,以培元(补心肾之气)填精益智、化痰祛瘀醒神立法,优化培元益智方,新组益智防呆方,观察其对学习记忆障碍小鼠的行为学影响,并在整体动物水平验证益智防呆方的改善认知作用。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1动物4w龄雄性清洁级昆明种小鼠,体质量(20±2)g,由上海中医药大学医学实验动物中心提供。安静环境下分笼饲养,室温控制在18~22℃,相对湿度50%~60%,光照充分,饮食、垫料及其他各项管理均按上海市清洁级实验动物管理标准执行。1.1.2药品安理申:卫材(中国)药业有限公司(批号:国药准字H20070181);氢溴酸东莨菪碱:公司(批号:S18751G);亚硝酸钠:国药集团化学试剂有限公司(批号:T20071213);无水乙醇:上海振兴化工一厂(批号:200907364);益智防呆方煎剂:复旦大学附属华东医院中药制剂室提供。

1.1.3仪器DT200小鼠跳台测试仪(成都泰盟科技有限公司)、通道式水迷宫(中国医学科学院药物所)、BA200小鼠避暗仪(成都泰盟科技有限公司)。

1.2方法

1.2.1实验分组与给药方法每部分72只雄性小鼠,分别用于检测药物对记忆获得、记忆巩固和记忆再现的影响。每部分小鼠随机分为6组:正常对照组(空白组)、模型对照组(模型组)、模型+小剂量益智防呆方干预组(小剂量组)、模型+中剂量益智防呆方干预组(中剂量组)、模型+大剂量益智防呆方干预组(大剂量组)、模型+西药安理申干预组(安理申组)。每组12只小鼠,分笼适应性喂养1w。在测试前连续给药7d,按照0.1mL/10g体质量的药量,每日灌胃1次。正常组、模型组用生理盐水灌胃,各给药组给予相应药物。安理申组给予安理申,按照60kg成人每日用药5mg的剂量,换算成小鼠的等效体重剂量给药。记忆获得、记忆巩固、记忆再现三个实验的给药均采用此方案。

1.2.2模型建立建立三种动物模型:记忆获得障碍模型、记忆巩固障碍模型、记忆再现障碍模型。按照《药理实验方法学》[6]中有关记忆障碍动物模型建立的步骤进行。(1)记忆获得障碍模型:灌胃1w后,对小鼠进行跳台法训练,训练前10min各组给予腹腔注射东莨菪碱4mg/kg,正常组腹腔注射等容量的生理盐水。训练后24h,先灌胃给药1次,1h后再行测试。跳台实验L6J前先将小鼠放入反应箱内适应3min,然后通以0,25mA交流电。小鼠受电击,正常反应是跳回平台以躲避伤害性刺激。多数小鼠可能再次或多次跳至铜栅上,受到电击后又迅速跳回平台。记录小鼠5min内第1次跳下平台的时间(潜伏期)和5min内跳下平台的次数(错误次数)。24h后重新测试,记录小鼠第一次跳下平台的(潜伏期)和5min内跳下平台的次数(错误次数),以此反映记忆保持情况。如小鼠5min未跳下平台,错误次数记为0,潜伏期记为300s。(2)记忆巩固障碍模型:灌胃后对小鼠进行通道式水迷宫训练,训练7d,1次/d,5min/次。训练7d后腹腔注射亚硝酸钠120mg/kg体质量,正常组腹腔注射等容量的生理盐水。训练后24h,先灌胃给药,1h后再行通道式水迷宫测试。通道式水迷宫[6]水深1000px,水温控制在22℃~25℃之间。迷宫共设4个盲端,终点有台阶,动物可通过台阶上岸躲避溺水威胁。小鼠在腹腔注射亚硝酸钠24h后,进行通道式水迷宫测试,测试在安静环境中进行。各模型组及对照组动物分别同时进行水迷宫测试,第1天路径设置2个盲端,第2天路径设置3个盲端,第3、4、5、6天路径均设置4个盲端。每天实验1次,测试6d。记录每只动物在游泳中进人盲端的次数(错误次数)及游出时间,如在第120s后未上岸,结束该次实验,游出时间按120s计算。(3)记忆再现障碍模型:灌胃1w后对小鼠进行5min避暗训练,24h后进行测试。测试前30min灌胃10%乙醇0,1mL/10g体质量,空白组灌服等量生理盐水。避暗实验L6]叉称为被动回避(passive avoidancc),是利用小鼠趋暗避明习性设计。实验装置分为明暗两室,两室之间有一直径为75px大小的圆洞,暗室底部铜栅接电,动物进入暗室即受到电击。以潜伏期为指标,动物的差异性较小,对记忆过程特别是记忆再现有较高的敏感度。训练前将小鼠头部背着洞口放入明室,先适应3min(不通电),然后给暗室铜栅通以36v、50Hz交流电,小鼠一进人暗室即受电击,其正确反应是回到明室,铜栅持续通电5min,作为训练过程。狂h后对小鼠进行记忆测试,记录小鼠第1次进人暗室的时间(潜伏期)和5min内小鼠进人暗室的次数(错误次数),如5min内仍未进入暗室,则潜伏期按300s记录,错误次数记为0。

1.3统计学方法数据结果以均数士标准差(x±s)表示,经SPSS19,0统计软件包进行单因素方差分析(one-way ANVA)。多个组间比较先行方差齐性检验,方差齐者再行单因素方差分析。P(0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1跳台实验结果

模型组潜伏期和错误次数与空白组比较差异有统计学意义(P<0.01),说明造模成功;中药小、中、大剂量组和安理申组的潜伏期明显长于模型组(P(0,01),错误次数明显小于模型组(P(0.01),说明中药组和安理申组对记忆获得障碍均有一定的改善作用。各药物组间比较,差异无统计学意义,见表1。

2.2通道式水迷宫实验结果

模型组游出时间和错误次数与空白组比较差异有统计学意义(P<0,O1),说明造模成功;中药小、中、大剂量组和安理申组的游出时间小于模型组(P<0,01),错误次数小于模型组(P(0,05,P<0.01),说明中药组和安理申组对记忆巩固障碍均有一定的改善作用。各药物组间比较,差异无统计学意义,见表2。

2.3避暗实验结果

模型组潜伏期与空白组比较明显缩短(P(0.01),错误次数减少(P<0.O5),说明造模成功;中药大剂量组和安理申组潜伏期长于模型组(P(0.05),中药小、中、大组和安理申组错误次数小于模型组(P<0.05),说明中药组和安理申组均对记忆再现障碍有一定的改善作用。各药物组间比较,差异无统计学意义,见表3。

3讨论

学习记忆是脑的高级功能,分为记忆获得、记忆巩固和记忆再现三个过程,中枢乙酰胆碱(acetylclloline,Ach)是参与学习记忆的重要神经递质。海马是学习记忆的重要脑区,海马-边缘系统有丰富的胆碱能神经纤维和胆碱敏感细胞与受体,与学习记忆有着密切关系。抗胆碱药东莨菪碱可降低中枢Ach含量,阻断或减弱Acll参与的学习记忆过程,引起的动物记忆获得障碍且与脑内Ach含量下降呈平行关系。本研究通过腹腔注射东莨菪碱复制记忆获得障碍模型,并采用跳台实验检测动物学习记忆功能,实验结果表明:与模型组比较,中药物组小鼠潜伏期明显延长(P<0.01),错误次数明显减少(P<0.01)。这提示益智防呆方能够改善记忆获得障碍小鼠的学习能力。

记忆巩固是记忆获得后信息在脑内编码存储和保持的过程。本研究通过腹腔注射亚硝酸钠复制记忆巩固障碍模型。亚硝酸钠[9]能使血红蛋白变性,使脑组织缺血缺氧,损伤学习记忆过程。实验结果表明:与空白对照组比,模型组小鼠的游出时间明显延长(P(0,01),错误次数明显增加(P(0.01)。与模型组比较,中药小、中、大剂量组和西药组的游出时间小于模型组(P(0.05),错误次数也小于模型组(P<0.05)。这提示中药组和安理申组均对记忆获得障碍有一定的改善作用。

乙醇对中枢神经系统具有广泛影响。乙醇对中枢神经系统的毒性作用是酒精性认知障碍的直接发病机制,虽无证据显示少量饮酒与MCI或AD发病存在必然关系,但过度饮酒可导致认知功能障。本研究采用40%酒精灌胃复制记忆再现障碍模型,并以避暗实验观察益智防呆方对记忆再现的影响,实验结果表明:与模型组比较,中药大剂量组和安理申组的潜伏期明显延长(P(0.05),各用药组的错误次数减少(P<0.05)。这说明中药组和安理申组均对小鼠记忆再现障碍有一定的改善作用。

轻度认知障碍(mild cogniove impalrment,MCI)是一种与年龄和受教育程度不相符的记忆功能障碍,不伴有其他认知功能损害,无痴呆表现。记忆功能属中医“神”的概念,“神”的物质基础由精气血津液提供,精气血津液的生成和运行均赖于五脏的正常,如五脏之盛衰太过或不及皆可致机体精气血津液的生成和运行异常。《内经》:“年过四旬,阴气自半”,说明人至中年,血行艰涩,年老体弱,气虚运血无力,血行瘀滞,易致瘀阻脑络。《格致余论》:“夫老人内虚脾弱,脾弱难化则食已而再饱,阴虚难降则气郁而成痰”,老年人五脏俱虚,脾虚则脾失健运,不能化湿,脾失其在水液代谢过程中的枢纽作用而成生痰之源,于是酿生痰浊于内。年老肾阳亏虚,蒸腾作用减弱,精液不能蒸化必然化作痰浊更加重了痰浊内阻之证。王永炎等[12]认为Mα的病机当为脑络痹阻、毒损脑络。肾精亏虚,精海不足,髓海空虚,使脑的供养不足或下降,失养或不养,神机失用,导致功能减退,出现记忆力下降。田金洲等[13]在一项对照研究中发现:在AD早期,遗忘型MCI(amnes⒒c MCI,aMCI)患者肾精亏虚证、气血亏虚证、痰浊证是最常见证候;而认知正常者(nrmal cogniuve state,NCS)的主要证候为肾精亏虚证、气血亏虚证、肝阳上亢证。由此可见aMcI患者痰浊证的发病率比NCS人群高。袁德培等[1d]认为MCI的根本病机是脾肾亏虚,脑失所养,神机失用,而痰浊、血瘀是导致记忆减退的病理基础。

综上所述,MCI属本虚标实之虚实夹杂证,治疗不宜单纯论补,既要填精补髓、补益虚损,叉要活血祛瘀、化痰开窍。李浩等[15]取补肝肾、填精髓、化痰浊、祛瘀血之法治疗老年MCI改善记忆障碍,收到较好疗效,并发现能提高病人生活质量、改善大脑动脉血流量,同时能改善大脑动脉的阻力指数及血液流变学的各项指标。研究发现:填精补髓、祛瘀化痰之法对改善MCI记忆障碍均收到较好疗效。

本研究以培元(补心肾之气)填精益智、化痰祛瘀醒神为立法原则,结合课题组专家治疗MCI临床经验,拟定益智防呆方。实验发现益智防呆方能改善学习记忆障碍小鼠的记忆获得、记忆巩固、记忆再现过程,对改善记忆障碍小鼠的记忆功能有效,其疗效与西药安理申比较无明显差异。本研究采用培元(补心肾之气)填精益智、化痰祛瘀醒神立法用药组方得以改善认知障碍小鼠的学习记忆功能,以方测证反验了心肾精气亏虚、痰瘀内阻在MCI发生发展中的科学性。同时临床亦可参照本法、遣方用药治疗MCI,对临床治疗MCI具有重要的指导意义。但本研究对探讨益智防呆方对改善小鼠记忆障碍是以小鼠行为学研究为基础,其分子生物学机制尚待进一步探讨。其他中医治疗MCI的研究亦多止步于改善MCI病人记忆障碍症状,未能进一步探讨其机制。因此,在下一步的研究中,课题组将对益智防呆方改善记忆障碍的分子机制进行研究,以期进一步了解MCI记忆障碍改善的分子生物学机制。

参考文献

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