硫酸镁对心肺复苏后大鼠大脑皮质水肿和水通道蛋白4基因表达的影响

心肺复苏(CPR)后早期即出现脑水肿,实验表明,大鼠CPR后早期脑水肿和水通道蛋白4(AQM) 基因表达具有相关性[12],故调控AQM的表达可以作为脑水肿的有效干预措施来使临床患者获益。有研究报道,硫酸镁(M￡04)能减轻神经元损伤,而脑细胞受损后水肿伴有AQM的表达上调[3],本研究采用窒息大鼠心肺复苏模型,探讨MgSo4对脑皮质含水量(CCWC)及脑皮质AQM mRNA表达的影响。

1 材料与方法

1,1 实验动物分组 采用雄性健康SD天鼠[由中科院上海动物实验研究所提供,合格证号:℃XK (沪)2OO7-O0OS],体质量(350± 50)g,共68只,随机分为三组:假手术组(屁=⒛ )、CPR模型组(瓦= 24)、M￡04治疗组(屁=z);根据观察时间点的不同,将每组再分为4个亚组,即自主循环恢复 (ROsC)后3、6、12、zh组,除了假手术组各时间点为5只大鼠外,CPR模型组和Mgs04治疗组各时相点均为6只大鼠。假手术组用3.6%水合氯醛按 10ml/kg进行腹腔内注射麻醉、气管插管、股动静脉置管,不建立窒息CPR模型,置管后待循环稳定开始计时,到达观察时间点后在麻醉状态下静脉注射氯化钾处死取脑。CPR模型组在进行水合氯醛麻醉、气管插管、股动静脉置管后建立窒息大鼠 CPR模型(详见模型制备),待ROSC后开始计时, 到达观察时间点后在麻醉状态下静脉注射氯化钾处死取脑。MgS04治疗组在进行麻醉、气管插管、股动静脉置管后建立窒息大鼠CPR模型,待RO℃ 后开始计时,并立即给予M￡04干预,至观察时间点后在麻醉状态下静脉注射氯化钾处死取脑。

1.2 模型制备 用3.6%水合氯醛(10mL/吒)腹腔注射麻醉,然后将大鼠固定于操作台上,并将操作台倾斜放置30° ,使大鼠的头端处于高位,直视下行气管插管。以zG套管针行股动、静脉置管,股动脉置管成功后接压力换能器。所有大鼠均行心电、肛温及有创动脉压监测。操作完成稳定10min后, 予纯氧机械通气1血n,呼吸机参数如下:呼吸频率 ω 犯/血n、潮气量7mL/坨,然后予空气继续通气4 而n,记录各组大鼠窒息前生命体征基线(见表1)。采用呼气末夹闭气管导管模拟窒息,CA判定标准如下:收缩压(SBP)≤ 笏mm Hg,并持续3血n。此后,开始复苏,予机械通气(呼吸频率gO次/俪n,潮气量7mL/kg和氧浓度100%),同时以食指和中指进行胸外心脏按压(频率⒛0犯/而n),按压深度为大鼠胸廓前后径的1/3。复苏开始10s后,经股静脉注射肾上腺素(0.01mg/kg)。ROSC的标志:出现自主心律和SBP≥ ω mm Hg,并持续10min以上[4]。肛温均控制在(36.5± 0.5)℃ 。MgS04治疗组在复苏后缓慢静脉推注(3ω umol/吒)15血n,而后持续静脉泵人[1⒛ umol/(kg· h)][5],到观察时间点后,在麻醉状态下以10%氯化钾2mL静脉注射处死大鼠获取脑组织标本。整个实验过程按 Utsteh模式[4]执行并稍作改良,动物处置方法均符合动物伦理学标准,各组大鼠在到达观察时间点之前均予5%GNs灌胃(10mL/kg,q6h),实验过程均在z~s℃ 恒温环境中进行。

1.3 主要实验仪器与试剂 ALC-Ⅴ8A动物呼吸机(上海奥尔科特生物科技有限公司),多导`b电监护仪(HEWLE叨PACKARD Ⅵridia⒛ C,Genmany), 血气分析仪(Nc,l/a statprosk M),电热恒温干燥箱 (上海跃进医疗器械一厂),万分之一电子天平(苏州市计量测试研究所),Ⅴnber凝胶成像分析系统 (法国humat公司),sT16R台式高速冷冻离心机 (北京博仪恒业科技发展有限公司),ABI叨OO CPR 扩增仪(美国应用生物系统中国公司),三恒 ECP3000多用电泳仪(北京市六一仪器厂),一步法 RNA抽提试剂盒T五zol(美国GIBC0公司),内对照 β-actin引物(Invitr。gen公司),AQM引物 (In访t而gen公司),琼脂糖(美国⒌gma~Ⅱ drich 公司)。

1.4 取材方法 各组大鼠到达相应的观察时间点后,在麻醉状态下静脉注射氯化钾处死大鼠,快速切开胸骨,暴露心脏,直视下将穿刺针经左心室传人升主动脉,剪开右心耳,经心脏快速灌注4℃ 生理盐水 250mL至右房流出液变清,迅速断头取脑。整个大脑用4℃ 生理盐水冲洗3次,切取左半脑并剪除多余皮质下组织,滤纸吸干表面水分,用电子天平称湿质量,gO℃ 干燥箱内烘烤72h后称干质量,计算脑皮质含水量:CCWC=[(湿质量-干质量)/湿质量]× 100%(见表2);取右大脑额叶皮贡⒛0mg, 用于AQM mRNA表达测定。

1.5 AQM mRNA表达测定 采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)测定:用Thzol:油提RNA;逆转录mRNA至cDNA;再用PCR扩增仪扩增cDNA。由invitrogen上海代理提供合成引物,AQP4引物:上游5′ -CGC CAA GTC CGT CTT CTA CATCA-3′ , 下游5′ -GGC CAA AGG ATC GA GCTG-3′ ,扩增产物大小323bp;β -actin引物:上游5′ -CAT CTC TTG CTC GAA GTCCA-3′ ∷下游5′ -ATC ATG叩 GAG ACC TC AACA-3′ ,扩增产物大小大小300bp。反应条件:94℃ 变性5min;94℃变性30s.55℃ 退火30s;72℃ 延伸30s,共30个循环;最后72℃ 7 而n。电泳后摄片,应用Ⅴllber凝胶成像分析系统进行吸光度扫描,以目的条带与β—achn的积分比值表示AQM的相对表达量(见表3和图1、2)。

1.6 统计学处理 用SPSS190统计软件,进行统计学分析,计量资料以均数±标准差(亍±s)表示,两组间均数比较用成组F捡验.多坦间均数比较用单因素方差分析,并进行相关性检验,P<0。OS为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠基线 每组大鼠在窒息前体温(T)、平均动脉压(MAP)、心率(HR)、pH值、动脉血氧分压(Pao2)、动脉血二氧化碳分压(Paco2)比较差异均无统计学意义(P)0.O~s),具有可比性,见表1。表2 CPR模型组和MgsO4治疗组从窒息开始至

2,2 窒息和复苏时间 CPR模型组和M￡04治疗组从窒息开始到心搏停止时间、总窒息时间、复苏至 ROSC时间相比较差异均无统计学意义(P)0。“ )。见表2。 23 脑皮质水含量比较 CPR模型组ROSC后3、 6、12、以h的脑皮质含水量较相同观察时间点的假手术组增加(均P(0。Os);M￡04组ROSC后3、6、12、叨h的脑皮质水含量较相同时间点的CPR组下调(均P<0。“)。见表3。

2,4 脑组织AQ弘mRNA表达水平比较 CPR模型组ROSC后3、6、12、γ h AQM mRNA表达均较假手术组明显增加(均P(0.“ );M驴04组ROSC 后3、6、12、z h AQM mRNA表达均较CPR组明显下调(均P(0.Os)。见表4。

2,5 脑组织AQⅡ mRNA表达电泳图像(见图1与 3 讨论心脏骤停是大脑缺血、缺氧造成继发性神经损害的重要原因,随着CPR技术和急诊医学的发展, 大多数患者能恢复自主循环,但均遗留有不同程度的神经功能障碍,使生活质量严重下降,造成家庭和社会的巨大负担。研究证实,脑水肿是CA患者神经功能障碍的主要病理生理过程,故如何预防和控制CA后脑水肿的发生和发展是减少继发性神经功能障碍的重要治疗措施,具有重要的临床意义。

本研究通过建立窒息法心肺复苏动物实验模型,观察CPR后早期运用MgS04干预脑水肿的发生和发展,以及MgS04对CCWC和AQ弘表达的影响, 探讨心肺复苏后MgS04能减轻脑水肿的作用机制。实验中,假手术组、CPR模型组和MgS04治疗组各项基本生命体征(HR、MAP、T)及血气分析指标 (pH、Pao2、PaC02)差异无统计学意义(P>0.O~s), 减少了实验干扰,保证了实验结果的精确性。脑细胞水肿是缺氧、缺血后造成的最早的形态学损伤表现之一,其病理机制是多因素的:6],Ⅺ ao 等在大鼠心脏停搏模型的研究中发现,心肺复苏后早期,大脑皮质中AQ昭已上调,并且和脑水肿严重程度相关。本研究通过干湿质量法测定CCWC 和RT-PCR测定大脑皮质AQM mRNA表达发现, 在CPR复苏组中,CCWC和AQM的表达明显比假手术组增高,进一步说明缺血缺氧以及再灌注导致了脑细胞水肿的发生,并且AQM参与了脑水肿的发生和发展,这和Xia。等[l]的研究结果是一致的。同时,该研究进一步阐明了AQM的过度表达与N- 甲基-D天门氨酸(N-methyl-D一钳pade, NMDA)受体相关C矿 +通道的大量激活有关。

Ca2+和AQPZI在脑水肿的发生和发展中起着相互推动作用:3],M呷σ等[7J报道,非竞争性NMDA受体拮抗剂氯化镁对年轻动物的脑缺血和脑外伤模型具有神经保护作用,并且耐受性良好。给予外源性 Mg2+能显著降低颅脑伤动物的病死率,促进神经功胄邕恢复。细胞内钙超载作为一个转录信号增加了 AQ弘mRNA的表达,进而导致和加重脑水肿的发生和发展[:]。M酽+是C'+的天然非竞争性抑制剂, 它能在一定程度阻断NMDA受体相关Ca2+通道的细胞内钙超载,从而减少Ca2+所介导的氧化损伤, 其中包括减少了AQM mRNA的表达:3]。

本研究叉发现,MgS04治疗组的AQM表达水平比CPR模型组的要明显降低,说明M眵04对于AQM mRNA的表达起到了抑制作用,减轻了脑水肿的发生和发展, 这与Yang等[9]的研究结果也是一致的。有研究[10]者发现,M驴04联合亚低温治疗比单纯使用亚低温疗效更显著,说明M￡04对于脑缺血后神经元的保护作用机制除了它是C矿 +的非竞争性抑制剂以外,可能还有其他的分子生物学机制。本实验证实了M￡04对大鼠脑缺血一再灌注后脑细胞的CCWC和AQM的影响,使我们对M岭04脑缺血后神经元的保护作用机制有了更深一步的了解。

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